Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đó, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc các cặn tƣơng ứng. Đem cân để xác định khối lƣợng các cặn. Việc thu nhận các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) xem sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) MÉu kh« nghiÒn nhá 1,2 kg CÆn n-Hexan Cof H: 80g B· 1 CÆn EtOAc Cof E: 42,3 g B· 2 B· 3 (Bá) n-Hexan(5x5l) C« kh« EtOAc 5x5l C« kh« MeOH5x5l C« kh« CÆn MeOH Cof M: 92,7g
Cặn đƣợc làm khô đến khối lƣợng không đổi và cân xác định trọng lƣợng. Từ lá cây Cà phê chè đã thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là:
Cof H, Cof E, Cof M Ở đó: Cof H : Cặn chiết n-Hexan
Cof E : Cặn chiết EtOAc Cof M : Cặn chiết MeOH
Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hoàng Quế, Đông Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1
Bảng 2.2: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) Mẫu thu vào tháng 12/2008 Khối lƣợng mẫu khô (g) (% so với trọng lƣợng khô)
Khối lƣợng cặn chiết khô (g) n-Hexan (% so với trọng lƣợng khô) EtOAc (% so với trọng lƣợng khô) MeOH (% so với trọng lƣợng khô) Lá 1200 (11,43%) 80,0 (6,67%) ( Cof H) 42,3 (3,53%) ( Cof E) 92,7 (7,73%) (Cof M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00
C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dƣơng tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với các flavonoit.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tính.
Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dƣơng tính đối với cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glucosit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1.
+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tính với vòng butenolit.
+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ
1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dƣơng tính.
Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.3: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica)
STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Cặn
tổng 1 Sterol Lieberman-Bourchardt Màu xanh
Màu vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam +
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt _ H2SO4 đặc Hồng nhạt _ NaOH đặc Vàng _ FeCl3 5% Xanh thẫm _
4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa _ 5 Glucosit trợ
tim
FeCl3 trong CH3COOH
+H2SO4đ Vàng nâu rõ ─
6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong
NaOH +
Chú giải: + : Phản ứng dƣơng tính ─ : Phản ứng âm tính