Xyloside-naringenin)
- Mẫu phấn hoa (450g) đ−ợc đem đi xay nghiền nhỏ rồi lần l−ợt chiết bằng ba dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, etyl axetat và metanol.
- Hợp chất 2 đ−ợc phân lập theo 2 cách sau đây:
*Cách 1: Lấy 3,2 gam dịch chiết trong metanol tổng của phấn hoa đã thu đ−ợc ở trên, tẩm silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) rồi quay khô đ−a lên cột ϕ3 theo ph−ơng pháp nhồi khô. Pha tĩnh đ−ợc dùng cũng là silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) với l−ợng gấp 30 lần khối l−ợng của chất đ−ợc đ−a lên cột. Chọn dung môi nhồi cột là etylaxetat và pha động chạy cột là hệ dung môi gradient etylaxetat - metanol. Sau khi chạy xong thu đ−ợc 63 phân đoạn, kiểm tra bản mỏng TLC và tiến hành gộp thu đ−ợc 5 phân đoạn chính ký hiệu là F1-F5. Phân đoạn F4 đ−ợc chạy TLC điều chế thu đ−ợc chất 2.
*Cách 2: Lấy 10 gam dịch chiết phấn hoa trong metanol đ−a lên cột Sephadex ϕ 3 theo ph−ơng pháp nhồi −ớt, với pha tĩnh là Sephadex LH 20, 25 - 100 mm mesh size (Merck), dung môi pha động đ−ợc sử dụng là 100% metanol thu đ−ợc 40 phân đoạn. Kiểm tra bản mỏng TLC tiến hành gộp các phân đoạn giống nhau thu đ−ợc 6 phân đoạn ký hiệu là F1-F6.
Phân đoạn F4 (đ−ợc gộp từ phân đoạn 28 đến phân đoạn 32) đ−ợc chạy trên cột ϕ 1 để tách tiếp, sử dụng pha tĩnh là silicagel 60, 0,04 - 0,06 mm mesh size (Merck) và hệ dung môi gradient diclometan-metanol thu đ−ợc 36 phân đoạn nhỏ ký hiệu là F4.1 – F4.36. Hợp chất 2 thu đ−ợc từ phân đoạn F4.17.
TLC điều chế EtylOAc/ MeOH Silicagel 60 0.04-0.063mm 100% MeOH SepHDAex LH 20,25 – 100 mm Sắc kớ cột (DCM/MeOH) Hình 2.3: Sơ đồ phân lập chất 2 * Dữ kiện phổ của chất 2
ESI-MS m/z: 427 [M+Na]+, 403,36 [M-H]-, 404,8 [M+H]+, Kết quả tính toán lí thuyết cho công thức phân tử là C20H20O9.
Rf = 0,55 (TLC, silicagel, hệ dung môi diclometan – metanol (9:1, v/v))
1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): δ 5,33 (dd, 5 Hz; 10 Hz, H-2), δ 2,70 (dd, 5 Hz; 15 Hz, H-3A), δ 3,01 (dd, 15 Hz; 20 Hz; H-3B), δ 6,34 (d, 2,2 Hz; H-6), δ 6,11 (d; 2,2 Hz; H-8), δ 7,30 (d; 8,8; H-2’), δ 6,80 (d; 8,8; H-3’), δ 4,88 (d; 5,0 Hz; H-1”); δ 3,44 (dd; 5,0 Hz; 15Hz; H-2”); δ 3,30 (dd; H-3”); δ 3,42 (dd; H-4”); δ 4,0 (dd; 5,0 Hz; 10 Hz; H-5”). F1 F2 F3 F4 F5 chất 2 DC Phấn hoa (MeOH) 3,2 gam F1 F2 (12 – 17) F3 F4 (28-32) F5 DC Phấn hoa (MeOH) 10 gam F6
Ch−ơng 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả nghiên cứu về Sữa ong chúa 3.1.1. Hàm l−ợng protein trong sữa ong chúa
Từ kết quả OD của mẫu sữa ong chúa là 0,636 ta có giá trị:
X = (0,636 - 0,0069 - 0,1842)/0,0034 = 131 àg/ml. Nồng độ protein trong sữa ong chúa là:
% pr = (131x 6)/ 6000x 100 = 13.1%
Sữa ong chúa chứa hàm l−ợng protein chiếm khoảng 13,1%. Trong khi đó hàm l−ợng protein trong mật ong chỉ là 0,2% [45].
Protein là chất dinh d−ỡng quan trọng, là cơ sở sinh học của sự sống, là nguyên liệu cấu thành nên các tổ chức, đóng vai trò quan trọng trong sự sinh tr−ởng và phát triển của cơ thể. Chúng tồn tại trong tất cả các tế bào, phân bố rất rộng trong cơ bắp, da, x−ơng, máu, tóc, móng tay, dịch tiêu hoá… Nó có rất nhiều chức năng nh− làm xúc tác cho các phản ứng; vận chuyển các chất trong cơ thể; tham gia vào quá trình chuyển động của các cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào; bảo vệ cơ thể bằng cách phát hiện và loại trừ những chất lạ xâm nhập vào cơ thể; điều hoà quá trình truyền thông tin, trao đổi chất. Ngoài ra, protein còn có chức năng dự trữ dinh d−ỡng [4]. Nhờ các chất đồng vị phóng xạ mà ng−ời ta xác định là một nửa l−ợng protein trong cơ thể đ−ợc đổi mới trong vòng 80 ngày. Nếu l−ợng protein cơ thể hấp thụ không đủ thì các cơ quan trong cơ thể dễ suy yếu và mắc bệnh. Vì thế trên thực tế, tình hình cung cấp protein cho cơ thể là tiêu chí cân bằng kết cấu thực phẩm và tình trạng dinh d−ỡng của con ng−ời. Do đó mà chúng ta luôn phải cung cấp đầy đủ protein. Nh− vậy với hàm l−ợng protein khá cao (13,1%), sữa ong chúa có thể đ−ợc sử dụng nh− một trong các nguồn cung cấp protein cho cơ thể con ng−ời.
3.1.2. Kết quả phân tích thành phần axít amin từ sữa ong chúa
Sau khi tiến hành chạy mẫu bằng chế độ chạy tự động trên máy ta thu đ−ợc sắc ký đồ đ−ợc trình bày ở hình 3.1:
Hình 3.1. Sắc ký đồ thành phần axit amin trong sữa ong chúa
Qua sắc ký đồ ta thấy axít aspartic có chiều cao pic là cao nhất đồng nghĩa với diện tích pic của nó lớn nhất nên hàm l−ợng của axít này trong sữa ong chúa so với các axít amin khác là cao nhất. Tiếp theo axít aspartic là axít glutamic, tiếp đến là các pic của các axit min có chiều cao pic hơn kém nhau không nhiều là valin, leucin, lysin, phenylalanin… và pic thấp nhất là histidin. Qua việc sử dụng các phần mềm trên máy tính ta thu đ−ợc bảng giá trị hàm l−ợng các axít amin có trong sữa ong chúa nh− bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hàm lượng các axít amin trong sữa ong chúa
( g axít amin/ 100g mẫu)
Từ bảng trên, ta xây dựng đ−ợc biểu đồ sau:
Stt Axít amin % Stt Axít amin %
1 Axít Aspartic 5.54 10 Cystein + cystin 0.45
2 Axít Glutamic 3.39 11 Valin 2.14
3 Serin 1.25 12 Methionin 0.60 4 Histidin 0.21 13 Phenylalanin 1.73 5 Glycin 1.30 14 Isoleucin 1.64 6 Threonin 1.54 15 Leucin 2.74 7 Alanin 1.15 16 Lysin 2.90 8 Arginin 1.64 17 Proline 0.97 9 Tyrosin 1.20 Tổng số 30.39
Axit Aspartic Axit Glutamic Serine Histidine Glycine Threonine Alanine Arginine Tyrosine Cysteine + cystine Valine Methionine Phenylalanine Isoleucine Leucine Lysine Proline other
Hình 3.2: Biểu đồ biểu thị hàm l−ợng axít amin trong sữa ong chúa
Axít amin chính là sản phẩm phân giải của protein, là đơn vị cơ bản tạo nên protein. Mục tiêu cuối cùng của quá trình con ng−ời hấp thụ protein là có đ−ợc các axít amin cần thiết cho cơ thể. Dựa vào bảng 3.1 và biểu đồ biểu thị hàm l−ợng axít amin trong sữa ong chúa ta thấy tổng số axít amin có trong sữa ong chúa t−ơng đối cao, chiếm khoảng 30,39 %. Trong số đó có chứa những axít amin thiết yếu đối với cơ thể con ng−ời nh−: valin (2.14%), leucin (2.74%), methionine (0.6%), threonin (1,54 %), phenylalanin (1.73%), lysin (2.90%), arginin (1.64%). Tất cả các axit amin này đều có hàm l−ợng t−ơng đối cao. Nh− vậy, với việc xác định đ−ợc hàm l−ợng các axít amin nói chung và các axít amin thiết yếu nói riêng thì ta thấy rằng sữa ong chúa cũng là một nguồn cung cấp các axít amin quan trọng cho cơ thể ng−ời.
3.1.3. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 1 (10-HDA)
Hợp chất 1: axít 10 – Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) đ−ợc phân tách từ dịch chiết CH2Cl2: MeOH d−ới dạng bột vô định hình màu trắng.
Trên phổ 1H - NMR cho thấy các tín hiệu rất đặc tr−ng của một axít béo có một nối đôi tại δ 5.81 ( dt, 1.5 Hz; 17Hz) và δ 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) là của H-2 và H-3 dạng trans. Ngoài ra tín hiệu triplet tại δ 3.56 (t, 6,5 Hz) là của proton H-10. Hai proton H-4 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 2,25 trong khi H-9 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 2,30. Bốn cặp proton H-5, H-6, H-7 và H-8 có các tín hiệu trùng lặp tại δ 1,55 ppm và δ 1,50 ppm .Phổ 1H –NMR của chất 1 đ−ợc mô tả ở hình 3.3 d−ới đây.
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất 1 (10-HDA)
Ngoài ra, dựa vào phổ khối bụi electron (ESI-MS) cho píc ion phân tử giả định [M+H]+ tại m/z 186.8 ứng với công thức phân tử C10H18O3.
Hình 3.4: Phổ ESI-MS của chất 1 (10-HDA)
Dựa vào phổ khối l−ợng phân tử và các tín hiệu trên phổ cộng h−ởng từ hạt nhân 1H-NMR, kết hợp với các tài liệu về phổ, hợp chất 1 đ−ợc xác định là axit 10-Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) phù hợp với các số liệu của tác giả Naoki Noda và cộng sự đã công bố vào năm 2005 [46]. D−ới đây là công thức của hợp chất 1.
Hình 3.5: Cấu trúc hợp chất 1 (axit 10-Hydroxy - 2- decenoic)
D−ới đây là bảng số liệu phổ 1H - NMR của chất 1 so với các dữ liệu của Naoki Noda [46].
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H –NMR của chất 1
C Số nguyên tử H δHa,c
, ppm (J, Hz)
theo tài liệu [28,46]
δHa,c , ppm (J, Hz) 1 - 2 1H 5,87(dt, 1.5Hz;15,6Hz) 5,81(dt,1,5Hz, 17Hz) 3 1H 6.94 (dt, 7.1Hz; 15.6 Hz) 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) 4 2H 2.22(ddt, 1.5Hz; 7.1 Hz; 7.6 Hz) 2,25 (m) 5 2H 1,48(m) 1,55 (m) 6 6H 1,35(m) 1,55 (m) 7 1,35 (m) 1,50 (m) 8 1,35(m) 1,50 (m) 9 2H 2,22 (m) 2,25(m) 10 2H 3,53(t, 6.6 Hz) 3.56 (t, 6,5 Hz)
10 - HDA là một axít béo có nhiều hoạt động d−ợc lý quan trọng đã đ−ợc công bố nh− có khả năng chống ung th−, làm tăng khả năng miễn dịch, kích thích sự sinh tr−ởng và phát triển của cơ thể... Do vậy việc phân lập và xác định đ−ợc cấu trúc của 10 - HDA là có ý nghĩa chứng minh trong sữa ong chúa có chứa thành phần quan trọng này. So với các tài liệu khác, 10-HDA đ−ợc phân lập từ sữa ong chúa đều sử dụng máy HPLC. Còn với nghiên cứu này chỉ cần dùng các ph−ơng pháp chạy cột sắc ký thông th−ờng đã phân lập
đ−ợc 10-HDA từ sữa ong chúa. Điều đó sẽ giúp chúng ta giảm rất nhiều chi phí khi phân lập hợp chất này.
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào
Kết quả thử hoạt tính gây độc lên tế bào ung th− biểu mô của dịch chiết sữa ong chúa đ−ợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả thử độc tính với tế bào ung th− biểu mô của sữa ong chúa
STT Ký hiệu mẫu IC50 ( àg/ml) 1 Sữa ong chúa > 256
2 Elipticin 0,31- 0,62
Elipticin là chất đã đ−ợc thế giới công nhận có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô với giá trị IC50 ở nồng độ khoảng 0,5 àg/ml. còn sữa ong chúa chỉ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô ở nồng độ 256 àg/ml trở lên. Điều này có thể giải thích là do hàm l−ợng 10-HDA chiếm khoảng 1-2% trong sữa ong chúa, do đó các phân đoạn 10- HDA sau đó đ−ợc phân tích và làm giàu từ mẫu sữa ong chúa sẽ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô ở nồng độ thấp hơn hàng trăm lần; hoặc dòng tế bào này ch−a phải là đích của các hoạt chất trong sữa ong chúa. Vì vậy sữa ong chúa chỉ có tác dụng phòng hoặc hỗ trợ điều trị với dòng ung th− biểu mô.
Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo trên các dòng tế bào ung th− máu, ung th− gan... có thể phải dựng với nồng độ cao hơn hoặc thử với các dịch chiết thành phần.
3.2. Kết quả nghiên cứu từ phấn hoa 3.2.1. Phân lập các dịch chiết 3.2.1. Phân lập các dịch chiết
Sau khi chiết mẫu phấn hoa có khối l−ợng là 450 gam trong các dung môi có độ phân cực tăng dần ta thu đ−ợc kết quả nh− sau:
- Dịch chiết phấn hoa trong n-hexan với khối l−ợng là 5,6 gam. - Dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat với khối l−ợng là 2,1388 gam. - Dịch chiết phấn hoa trong metanol với khối l−ợng là 152,16 gam.
3.2.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin) naringenin)
Hợp chất 2 (7-O- β - Xyloside-naringenin) đ−ợc phân lập từ dịch chiết phấn hoa trong metanol d−ới dạng tinh thể màu trắng.
D−ới đây là sắc ký đồ HPLC và phổ UV của hợp chất 2.
Hình 3.7: Phổ UV – pic 1
Hình 3.8: Phổ UV – Pic 2
Trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu rất đặc tr−ng của hệ vòng thơm AA’BB’ của vòng B đ−ợc quan sát tại δ 7,30 (d; 8,8 Hz) và 6,80 (d; 8,8 Hz) là t−ơng ứng của hai cặp proton H-2’/H-6’ và H-3’/H-5’. Hai proton t−ơng tác
meta – của vòng A cộng h−ởng tại δ 6,34 (d; 2,2 Hz); 6,11 (d; 2,2 Hz) là thuộc về H -6 và H-8. Proton H-2 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 5,33 d−ới dạng douplet có hằng số t−ơng tác spin 5Hz và 10Hz. Hai proton H-3A và H-3B đ−ợc quan sát tại δ 2,07 và δ 3,01 có hằng số t−ơng tác spin 15Hz và 20 Hz. Trên phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự có mặt của phần đ−ờng do xuất hiện tín hiệu cộng h−ởng của proton anomeric tại δ 4,88 (1H; d; 5,0 Hz) bị khuất bởi pic n−ớc và các proton của phần đ−ờng cộng h−ởng tại δ 3,61; δ 3,56 và δ
3,42. Phổ 1H- NMR của hợp chất 2 đ−ợc trình bày ở hình 3.9. P e a k # 21 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 3 2 0 2 . 4 2 8 2 . 4 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d ! P e a k # 11 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 1 2 8 2 . 3 5 6 3 . 6 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d !
Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2
Trên phổ khối bụi điện tử (positive mode) cho ion pic giả định phân tử tại m/z 404,8 [M+H]+, (negative mode) tại m/z 403.0 [M-H]-, tại m/z 427 [M+Na]+, chỉ ra khối l−ợng phân tử của hợp chất 2 là 404 ứng với công thức C20H20O9. Phổ khối bụi điện tử của chất 2 đ−ợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Phổ ESI – MS của chất 2
Dựa vào phổ khối l−ợng phân tử và các tín hiệu cộng h−ởng từ hạt nhân, kết hợp với các tài liệu về phổ, hợp chất 2 đ−ợc xác định là 7-O- β - Xyloside-naringenin. Công thức cuủa chất 2 đ−ợc xác định nh− sau:
Hình 3.11: Cấu trúc của chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin)
D−ới đây là bảng số liệu các dữ kiện phổ 1H - NMR của chất 2 so với các tài liệu.
Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H –NMR của chất 2 Vị trí δH(ppm), J (Hz) *δH(ppm),J Hz) [49,57] Aglycon 2 5,33 (dd; 5;10) 5,98 (dd; 5,25, 12) 3A 3B 2,70 (dd; 5; 15) 3,01 (dd; 15; 20) 2,80 (d; 17) (eq) 3,31 (q; 2,0) (ax) 4 5 6 6,34 (d; 2,2) 6,42(d; 2,5) 7 8 6,11(d; 2,2) 6,84(d; 2,5) 9 10 1´ 2´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d; 8,5) 3´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8.5) 4´ 5´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8,5) 6´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d;8,5) Xylose 1´´ 4,88 (d; 5,0) 4,85 (d;7,8)) 2´´ 3,44 (dd; 5,0; 15) 3,40 (m) 3´´ 3,30 (dd) 3,29 (ddd; 8,7; 8,7; 4,2)
4´´ 3,42 (dd) 3,42 (m) 5´´ 4,0 (dd; 5,0; 10) 3,81 (dd; 4,0; 10,8)
Hợp chất 2 xác định đ−ợc là một glycozit flavonoit, theo nhiều công bố lớp chất này có hoạt tính chống oxi hoá mạnh, nên việc phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất 2 là rất có ý nghĩa. Điều này khẳng định thêm rằng trong phấn hoa chứa flavonoit là những tác nhân có hoạt tính chống oxi hoá.
Flavonoit là một lớp chất khá phổ biến xuất hiện trong thực vật d−ới dạng tự do hoặc glycozit. Chúng là những sản phẩm đ−ợc thiết lập từ một đơn vị gốc cinnamoyl-CoA, với sự kéo dãn mạch dùng ba phân tử malonyl-CoA.
Flavonoit góp phần cấu thành màu sắc của thực vật và hấp thụ mạnh tia UV. Tuy nhiên một số flavon không màu nh−ng vẫn hấp thụ rất mạnh các tia UV.
OH CoAS O + 3 Malonyl-CoA -3 CO2 -3 CoASH OH O O O O SCoA OH O O O O - CoASH OH O OH OH HO Chalcone OH O OH O HO Naringenin (Flavanone) OH O OH O HO OH Dihydrokaempferol (Flavanonol or Dihydroflavonol) OH OH OH O HO OH Leukopelargonidin (Flavan-3,4-diol) OH O OH O HO OH Kaempferol (Flavonol) OH O OH O HO Apigenin (Flavon) Red. Oxi. Oxi. Enzymmatic Chalcone-Flavone- isomerase Spontan
Hình 3.12: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp các Flavonoit
Ngoài ra, 7 - O - β - Xyloside - naringenin có thể đ−ợc sinh tổng hợp theo sơ đồ sau nhờ sự có mặt của E .coli [18].
Hình 3.13: Sơ đồ sinh tổng hợp của 7 – O - β– Xyloside – naringenin [18] 3.2.3. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá
Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá (peroxydaza) đ−ợc trình bày ở bảng 3.5 nh− sau:
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa
STT Mẫu IC50 (àg/ml) 1 Dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat 65,88
2 Dịch chiết phấn hoa trong metanol 46,0
3 Dịch chiết phấn hoa trong n-hexan 104,8
4 Resveratrol 5,24
Kết quả ở bảng 3.5 đ−ợc biểu diễn ở hình 3.19.
0 20 40 60 80 100 120
P_H(etylaxetat) P_H (metanol) P_H (n-hexan) Resveratrol
Hình 3.14: Biểu đồ hoạt tính của phấn hoa
Theo bảng 3.5 và hình 3.14 cho thấy resveratrol là một chất có khả năng chống oxi hoá tốt đã đ−ợc thế giới công nhận và đ−ợc sử dụng nh− là đối chứng d−ơng có giá trị IC50 ở nồng độ 5,24 àg/ml. Trong ba dịch chiết của phấn hoa thì dịch chiết phấn hoa trong metanol là có khả năng chống oxi hoá