Nguyên tắc chung:
Điện di là kỹ thuật đƣợc sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA sản phẩm của PCR [13].
Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt (ở pH = 7) do sự có mặt của gốc PO4
3-
. Do đó, khi đặt nucleic acid trong điện trƣờng với cƣờng độ và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ dịch chuyển qua bản gel từ cực âm (cathode) sang cực dƣơng (anode). Trên cùng một bản gel, với cùng một cƣờng độ dòng điện, những phân tử DNA khác nhau về trọng lƣợng nên khác nhau về điện tích và chạy đƣợc những quãng đƣờng khác nhau sau cùng một khoảng thời gian. Gel đƣợc sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, ngƣời ta dùng phƣơng pháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, ngƣời ta nhuộm bằng EtBr. Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dƣới tia tử ngoại. Nhƣ vậy cho phép dễ dàng phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt đƣợc phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối với gel polyacrylamide, các phân tử thƣờng đƣợc đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng trên bản gel sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi [13].
Trong điện di, ngƣời ta sử dụng thang DNA chuẩn cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lƣợng phân tử, hoặc trích li đƣợc các DNA khác nhau [13].
Quy trình kỹ thuật:
Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống soi chụp gel. Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng gel agarose 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích.
- Cân 0,8 g thạch agarose vào 100 ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng đun cho gel nóng chảy và không tạo bọt.
- Để nguội đến khoảng 50 - 55oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Đợi thạch đông và ổn định.
- Sau khi gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ đệm vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm. Ở đây, chúng tôi dụng đệm TAE 1X.
- Tra mẫu DNA: trộn một lƣợng mẫu thích hợp với 3 l dung dịch đệm tra mẫu (loading dye), sau đó tra vào các giếng trên bản gel. Tra DNA chuẩn vào một giếng, đậy nắp bản gel và cắm điện cực.
- Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100 - 120 V, cƣờng độ 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút.
- Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và nhuộm bản gel trong EtBr 10 g/ ml. Lấy bản gel ra sau 5 - 10 phút và rửa trong nƣớc sạch.