CÁC GIỐNG LẠC BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO
3.3.1. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh
Sau khi đánh giá khả năng chịu hạn của các giống, chúng tôi đặt ra vấn đề cần nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK là những giống có khả năng chịu hạn kém. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống L23, L08, LTB, LCB, LBK ở mức độ mô sẹo, chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng tế bào chịu hạn đối với giống L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô. Tuy nhiên để khẳng định được chắc chắn đó là các ngưỡng xử lý có hiệu quả đối với các giống cần phải tiếp tục theo dõi ở ngoài đồng ruộng, đánh giá các dòng cây thu được ở các thế hệ R0, R1, R2 ...bằng các phương pháp sinh lý, sinh hóa và các đặc điểm nông sinh học.
Từ việc xác định ngưỡng chọn dòng ở trên, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc hàng loạt dòng tế bào chịu hạn của 5 giống L23, L08, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật thổi khô luồng khí vô trùng của box cấy. Các khối mô sau thổi khô ở các ngưỡng chọn dòng được chuyển lên môi trường tái sinh cây để tiếp tục theo dõi khả năng sống sót và tái sinh cây. Kết quả thu được 159 dòng mô chịu mất nước và tái sinh được 315 dòng cây xanh phục vụ cho cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học quần thể R0
Cây tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước của 5 giống nghiên cứu là L23, L08, LTB, LCB và LBK được chuyển vào môi trường tạo rễ, khi rễ dài từ 3cm - 4cm cấy chuyển trồng ngoài đồng ruộng trong vụ xuân 2008. Tiến hành chăm sóc dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và đối chứng trong điều kiện như nhau. Kết quả nghiên cứu ngoài đồng ruộng cho thấy, có sự sai khác
về các đặc điểm nông học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc.
Sự sai khác về các đặc điểm như chiều cao cây, số cành/cây, số quả/cây, thời gian sinh trưởng, kích thước quả, kích thước lá, số rễ và chiều dài rễ...ở quần thể R0 của các giống lạc L23, L08, LTB, LCB và LBK có xu hướng biến thiên gần như nhau. Vì vậy chúng tôi chọn kết quả của giống lạc LCB làm đại diện để trình bày trong bảng 3.18
Bảng 3.18. Mức độ biến động di truyền quần thể R0 của giống lạc LCB STT Chỉ tiêu theo dõi LCB đối chứng Quần thể R0
X± mx Cv (%) X± mx Cv (%) 1 Chiều cao cây (cm) 49,44±2,65 3,37 48,96±1,88 22,11
2 Số cành/cây 8,56±0,44 5,58 2,03±0,27 76,38
3 Số quả chắc/cây 22,33±1,74 6,68 2,63±0,45 80,12 4 Chiều dài quả (mm) 33,92±1,53 7,83 28,30±3,36 20,59 5 Chiều rộng quả (mm) 14,83±0,17 2,06 16,57±1,52 15,86
6 Số lượng rễ 13,22±0,68 5,48 1,39±0,21 56,51
7 Chiều dài rễ (cm) 16,33±1,96 3,60 3,57±0,57 85,20
Chiều cao cây
Chiều cao của cây lạc là kết quả của sự kết hợp giữa quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực [38]. Tính trạng chiều cao cây chủ yếu do đặc tính di truyền quyết định. Trong 5 giống nghiên cứu, quần thể R0 giống LTB và L08 có chiều cao cây giảm so với giống gốc, từ 8,32% - 17,49%. Còn 2 giống LCB, L23 chiều cao cây không có sự sai lệch so với đối chứng, chiều cao cây của quần thể R0 có nguồn gốc từ giống LCB đạt 48,96cm, đối chứng đạt 49,44cm. Riêng quần thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống LBK có chiều cao cây lớn hơn giống gốc, gấp 1,45 lần (tăng 44,91% so với đối chứng).
Số cành/ cây
Số cành/cây liên quan trực tiếp đến số quả, thường các giống lạc chỉ có hai cấp cành với tổng số từ 6 - 10 cành. Số cành/cây phụ thuộc khá lớn vào điều kiện ngoại cảnh [12]. Kết quả theo dõi thí nghiệm cho thấy, ở cả 5 quần
thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo xử lý thổi khô đều có số cành/cây giảm, giảm từ 55,53% - 78,13% so với giống gốc. Cụ thể giảm nhiều nhất là các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống L23 (giảm 78,13%), tiếp đến là giống LCB (giảm 76,28%). Số cành/cây là một trong các chỉ tiêu biến đổi mạnh nhất ở thế hệ R0 (Cv%=76,38% so với đối chứng Cv%=5,58%). Số lượng cành/cây của thí nghiệm giảm, điều này chứng tỏ rằng trong quá trình tạo mô sẹo, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh, các dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã chịu các tác động cơ học, ảnh hưởng tới các mầm nách ở các đốt trên thân, làm cho các đốt ngắn lại hoặc trùm lên nhau, đặc biệt là các đốt thứ nhất và thứ hai, đây là các đốt có vai trò quan trọng trong sự phân cành và tạo quả lạc [38].
Số quả/cây, kích thƣớc quả
Quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu đều có số quả/cây giảm rất lớn so với giống gốc, giảm >80%. Số quả chắc/cây có mối tương quan thuận và chặt chẽ với năng suất, chỉ tiêu này phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống và sự tác động của điều kiện ngoại cảnh. Trong 7 chỉ tiêu theo dõi thì số quả/cây của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo được xử lý thổi khô biến đổi mạnh nhất (Cv%=80,12%, ĐC Cv%=6,68). Số quả/cây của các dòng thí nghiệm biến thiên từ 0-6 (quả), đối chứng biến thiên từ 20-28 (quả). Xuất hiện các biến dị về hình dạng quả như: eo thắt, mỏ quả, đường vân trên vỏ quả...Các đặc điểm về mỏ quả, độ thắt, kích thước trọng lượng quả và số hạt là những chỉ tiêu để phân loại các giống lạc [38].
Kích thước quả (chiều dài và chiều rộng quả) đều giảm so với đối chứng, nhưng giảm không nhiều. Chiều dài giảm từ 4,57% - 26,79%, chiều rộng giảm từ 7,56% - 33,52%. Các dòng lạc có nguồn từ mô sẹo chịu mất nước của giống LCB có chiều dài quả giảm 16,56% so với giống gốc, nhưng lại có chiều rộng quả tăng 11,73% so với đối chứng. Nhìn
chung ở cả 5 quần thể R0 kích thước quả không có sự biến động lớn so với đối chứng (Cv% thí nghiệm dao động từ 5,15% - 21,20%, đối chứng dao động từ (1,64%-7,51%).
Số lƣợng rễ và chiều dài rễ
Số lượng rễ và chiều dài rễ của các dòng lạc thí nghiệm đều giảm rất nhiều so với giống gốc (số lượng rễ giảm 89,49%, chiều dài rễ giảm 78,14%). Quan sát quần thể R0 của cả 5 giống nghiên cứu đều nhận thấy rằng, rễ được tạo thành trong nuôi cấy in vitro khi cấy chuyển ra đồng ruộng đa số là bị đứt, để hình thành rễ mới. Tuy nhiên, số lượng rễ mới được hình thành ở mỗi dòng lại rất ít. Theo chúng tôi, kết quả thu được này là phù hợp vì rễ lạc phát triển mạnh từ lúc cây bắt đầu mọc cho đến khi có 5 lá, sau đó giảm dần, đến khi ra hoa và hình thành quả, hạt tốc độ phát triển của rễ giảm tối đa [38].
Những biến đổi về các đặc điểm nông học ở quần thể R0 đã chứng tỏ, mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô ở các ngưỡng chọn dòng đều có sự biến đổi lớn về các đặc tính sinh lý dẫn tới sự biến động về các tính trạng hình thái. Đây là cơ sở cho công tác tạo nguồn vật liệu khởi đầu và chọn ra được các dòng chịu hạn bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Sự sai khác về các đặc điểm nông sinh học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc mà chúng tôi thu được phù hợp với những nghiên cứu trước đây trên nhiều đối tượng như lúa, lạc, thuốc lá [31], [33], [40], [43]...
Qua phân tích và chọn lọc ở quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu là L23, L08, LTB, LCB và LBK chúng tôi có một số nhận xét sau:
- Mô chọn lọc từ giống lạc L08 thu được biến dị về thời gian sinh trưởng (ra hoa muộn hơn 15 ngày so với các giống L23, L08, LTB, LCB ), chiều cao cây thấp.
- Mô chọn lọc từ giống lạc LCB thu được biến dị về chiều rộng quả, thời gian sinh trưởng (ra hoa sớm hơn).
- Mô chọn lọc từ giống lạc LTB thu được biến dị về kích thước quả (chiều dài và chiều rộng quả đều lớn hơn so với đối chứng). Chiều dài đạt 29,08mm tăng 19,18%, chiều rộng đạt 12,9mm tăng 11,97% so với giống gốc.
- Mô chọn lọc từ giống lạc LBK thu được biến dị về chiều cao cây, chiều cao cây tăng gấp 1,45 lần so với đối chứng.
+ Dòng 15(D15), dòng 32(D32) quả có eo thắt đặc biệt. + Dòng 4 (D4), dòng 12 (D12) quả có 3 hạt. A B C D
Hình 3.11. Một số hình ảnh về biến dị quả của các dòng chọn lọc từ giống LBK
A. Quả đối chứng B. Biến dị eo thắt quả C. Biến dị quả 3 hạt D. Biến dị mỏ quả
Hình 3.12. Một số hình ảnh các dòng tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống LCB ngoài đồng ruộng
3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nƣớc và đặc điểm nông học quần thể R0
(1) Ngưỡng chọn lọc các dòng mô chịu hạn ở 5 giống lạc nghiên cứu L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô.
A: Giống gốc LCB
B: Các dòng thuộc quần thể R0 khi ra hoa
C: Quần thể R0 khi tạo quả
D: Quả lạc đối chứng
E: Quả lạc thuộc các dòng có nguồn gốc
từ mô sẹo mất nước
A D
B E
(2) Đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô có khả năng chịu hạn và 315 dòng cây xanh của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
(3) Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền lớn về các đặc điểm nông học (chiều cao cây, số cành/cây, số quả chắc/cây, kích thước quả, số lượng và chiều dài rễ, thời gian sinh trưởng...). Đây là đặc điểm thuận lợi cho việc chọn ra các cá thể đầu dòng theo yêu cầu tạo giống.
Tuy nhiên, để khẳng định được khả năng di truyền, tính chịu hạn của các dòng và những biến dị có lợi xuất hiện ở quần thể R0 thì cần phải tiếp tục theo dõi, đánh giá bằng các phương pháp sinh lý, hóa sinh ở các thế hệ tiếp theo.
3.4. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC
Trong những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã và đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong các nghiên cứu như: Phân tích và đánh giá bộ genome của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47] , sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống, đánh giá một cách hữu hiệu tính đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [33], [47]... Sự ra đời và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại là những công cụ đắc lực ngày càng được áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng.
Các dòng lạc tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước được trồng ở vụ xuân 2008, chúng tôi đã chọn được 5 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của giống lạc địa phương Cao Bằng (LCB). Đây là những dòng có một số đặc điểm nông học sai khác so với giống gốc để phân tích đặc điểm genome bằng kỹ thuật RAPD, làm cơ sở cho các nghiên cứu chọn lọc tiếp theo.
3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Kết quả tách chiết ADN từ lá lạc của các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước được trình bày ở bảng 3.19.
Bảng 3.19 cho thấy tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,83-1,92 và OD260/OD230 dao động từ 1,80-1,87. Khoảng biến động này đều nằm trong giới hạn cho phép (1,8 - 2,0). Điều này khẳng rằng định các mẫu ADN tách chiết được đều sạch.
Bảng 3.19. Độ sạch và hàm lượng ADN của các mẫu lạc nghiên cứu
Tên mẫu OD260 OD260/OD230 OD260/OD280
Hàm lƣợng ADN (ng/l) LCB 0,02640 1,82 1,86 264,0 D2 0,02475 1,83 1,92 247,5 D18 0,02578 1,80 1,83 257,8 D21 0,02514 1,80 1,90 251,4 D67 0,02637 1,87 1,87 263,7 D121 0,02352 1,81 1,85 235,2
Ngoài phương pháp đo quang phổ hấp thụ, chúng tôi còn sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di trên cho thấy, các mẫu ADN tách chiết từ lá lạc cho một băng duy nhất, sắc nét, có phân tử lượng cao, ở gần giếng và không có sự đứt gãy của các phân tử ADN.
3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD
ADN tổng số của 5 dòng chọn lọc và giống gốc được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (Polymorphism information content), giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao, tính khoảng cách di truyền thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây.
3.4.2.1. Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN đƣợc nhân bản
Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình ADN của 6 mẫu cây nghiên cứu.
Bảng 3.20 cho thấy, số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 29-62 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 250-2000bp. Tổng số phân đoạn ADN nhân bản được của 10 đoạn mồi RAPD khi phân tích 6 mẫu lạc là 404. Trong số 10 mồi phân tích, số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 là nhiều nhất (62 phân đoạn ADN) và ít nhất là mồi DTN19 (29 phân đoạn). Tổng số phân đoạn được nhân bản của các mẫu lạc dao động từ 61-71 phân đoạn. Trong đó, hai dòng D21 và D67 cùng nhân được 71 phân đoạn ADN
Bảng 3.20. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên
Mồi LCB D2 D18 D21 D67 D121 Tổng số phân đoạn ARA42 6 6 6 6 6 6 36 CUM43 5 5 5 5 5 5 30 DTN05 5 5 6 6 6 6 34 DTN13 7 7 7 7 7 7 42 DTN15 9 9 11 11 11 11 62 DTN19 7 5 2 5 5 5 29 OPE10 5 5 8 8 8 8 42 OPM46 6 6 6 6 6 6 36 OSP31 7 7 9 9 9 8 49 UPH04 6 6 8 8 8 8 44 Tổng số 63 61 68 71 71 70 404
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi. Kết quả ở bảng 3.21 cho biết, tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc khi phân tích 10 mồi ngẫu nhiên là 74 phân đoạn. Trong đó số phân đoạn đa hình là 16 (chiếm 21,62%) và không đa hình là 58 (78,38%). Trong số 10 mồi nghiên cứu có 4 mồi không cho tính đa hình. Mồi DTN19 cho tính đa hình cao nhất (75%), 4 mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và OPM46 không cho tính đa hình (0%).
Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình (giá trị PIC). Cụ thể: giá trị PIC của mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và OPM46 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi DTN19 là 0,55 (đa hình cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Hầu hết các mồi đều cho tính đa hình không cao (PIC < 0,5). Mặc dù vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên này cũng đã thể hiện được tính đa hình của 6 mẫu nghiên cứu.
Bảng 3.21. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên Mồi Số phân đoạn ADN Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình % phân đoạn đa hình Giá trị PIC ARA42 6 0 6 0,00 0,00 CUM43 5 0 5 0,00 0,00 DTN05 6 1 5 1,67 0,09 DTN13 7 0 7 0,00 0,00 DTN15 11 2 9 18,18 0,10 DTN19 8 6 2 75,00 0,55 OPE10 8 3 5 37,50 0,21 OPM46 6 0 6 0,00 0,00 USP31 9 2 7 22,22 0,15 UPH04 8 2 6 25,00 0,14 Tổng số 74 16 58 21,62 1,24