Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như acid acetic, acid focmic. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp carbamat 1000ppb để khảo sát thành phần pha động khi có thêm chất trên, các điều kiện chạy máy được cố định như sau:
- Cột Symestry Shield Water C18 và tiền cột. - Detector: khối phổ.
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Pha động: kênh B là methanol, kênh A lần lượt là acid focmic 0,1%, acid acetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nước.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thành phần pha động
Carbamat
Diện tích pic St
Acid focmic 0,1% Acid acetic 0,1% CH3COONH4 0,1%
Carbofuran 88164531 62596017 52548096
Propoxur 8023138 7095289 5289116
Carbaryl 8972544 4205380 3950325
Nhận xét: Sử dụng pha động là acid focmic 0,1% cho diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phương pháp. Do đó, chúng tôi chọn pha động là methanol và dung dịch acid focmic 0,1% trong nước cho các khảo sát tiếp theo.
Trong phương pháp nghiên cứu, pha tĩnh sử dụng là cột C18, ít phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Chất tan ít phân cực sẽ bị lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực. Do tính chất kém phân cực của các chất nhóm carbamat nên chúng tôi chọn pha động trên 2 kênh:
o Kênh A: dung dịch acid focmic 0,1% trong nước.
o Kênh B: dung môi methanol.
Chọn dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 chất nhóm carbamat 1000ppb để khảo sát tỉ lệ dung môi, cố định các điều kiện:
- Cột Symestry Shield Water C18 (150mm x 4,6mm x 5mm).
- Cột bảo vệ: Symestry Water C18 (20 mm x 3,9 mm x 5mm). - Detector: MS/MS.
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Thời gian chạy: 30 phút.
Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi pha động được chỉ ra ở bảng dưới đây.
Bảng 3.5.Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi pha động tới thời gian lưu.
Tỉ lệ pha động Thời gian lưu (phút)
% A % B Carbofuran Propoxur Carbaryl Fenobucarb
10 90 3,83 3,78 4,12 4,34
20 80 4,36 4,30 4,91 5,52
30 70 5,29 5,23 6,43 8,29
50 50 11,48 11,49 17,82 Không thấy
Nhận xét: Từ bảng kết quả trên ta thấy, khi để thành phần pha động chạy với chế độ đẳng dòng isocractic, tỉ lệ methanol càng cao, thời gian lưu càng giảm, các chất không tách ra khỏi nhau. Hơn nữa, khi chất phân tích ra quá sớm, rất dễ bị ảnh hưởng bởi các tạp chất. Ngược lại, khi lượng methanol càng giảm thì thời gian lưu tăng, các chất tách ra khỏi nhau nhưng thời gian chết giữa các chất cũng tăng theo, làm tăng thời gian phân tích và tốn dung môi. Do đó, để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient.
Bảng 3.6.Chương trình chạy gradient rửa giải các chất carbamat
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) HCOOH 0,1 % MeOH 0 0,5 90 10 1,0 0,5 50 50 6,0 0,5 20 80 12,0 0,5 0 100 13,0 0,5 0 100 15,0 0,5 90 10 18,0 0,5 90 10
Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:
Cột Symestry C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm).
Tiền cột Symestry C18 của Water (20 mm x 3,9 mm x 5mm).
Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid focmic 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH.
Chương trình chạy gradient ở bảng 3.6.
Tốc độ dòng 0,5ml/phút.
Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.3.