Cấu trỳc của cỏc hợp chất được xỏc định bằng cỏch kết hợp cỏc phương phỏp phổ:
Phổ hồng ngoại (IR);
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn proton (1H-NMR);
Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trỡnh DEPT.
2.3 Phương phỏp đỏnh giỏ hoạt tớnh chống oxi húa
Cỏc hợp chất phenolic được phõn lập đó được đỏnh giỏ hoạt tớnh chống oxi húa in vitro theo phương phỏp quột gốc tự do DPPH của S. G. Olga et al. (2003).
Thử nghiệm hoạt tớnh chống oxi húa được thực hiện tại Phũng Sinh học thực nghiệm, Viện Húa học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, Viện Khoa học và cụng nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG III
PHẦN THỰC NGHIỆM
3.1 Thiết bị và hoỏ chất - Cỏc phương phỏp sắc ký - Cỏc phương phỏp sắc ký
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trờn nền nhụm. Phỏt hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đú hơ núng bản mỏng ở 1200 và đốn tử ngoại ở bước súng λ = 254 nm.
Sắc ký cột thường (CC)
Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung mụi. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 àm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).
Sắc ký cột nhanh (FC)
Phõn tỏch sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới ỏp suất nộn. Chất hấp phụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μm và 63-100 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).
Cỏc cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) cú đường kớnh khỏc nhau được sử dụng tựy theo khối lượng mẫu cần phõn tỏch.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)
Phõn tỏch sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế cỏc hợp chất hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. ì 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C.
- Cỏc phương phỏp phổ
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS)
Phổ EI-MS được đo trờn thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MS Engine và Waters Autospec Premier.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR)
Cỏc phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trờn thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoỏ học δ được biểu thị bằng ppm. Tớnh bội của cỏc tớn hiệu 13C được xỏc định trờn cơ sở cỏc phổ DEPT 90 và DEPT 135.
3.2 Nguyờn liệu thực vật
Thõn rễ tươi cõy Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen (Zingiberaceae) (20 kg) đó được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bỡnh (Viện Sinh thỏi và Tài nguyờn Sinh vật, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam) thu thập vào thỏng 11 năm 2007 tại xó Liờm Phỳ, Văn Bàn, Lào Cai.
Mẫu sau đú được rửa sạch, thỏi lỏt mỏng, phơi khụ trong búng rõm và sấy khụ ở 40oC. Mẫu khụ (1,6 kg) được xay thành bột mịn.
3.3 Điều chế cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
Mẫu bột khụ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngõm chiết trong dung mụi axeton ở nhiệt độ phũng. Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu được dịch chiết axeton đầu tiờn. Tiến hành lặp lại quỏ trỡnh ngõm mẫu trong axeton thờm 4 lần nữa. Cuối cựng lọc bỏ bó thực vật thu được dịch chiết axeton. Dịch chiết sau 5 lần ngõm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung mụi dưới ỏp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để trỏnh làm biến chất cho đến khi thu được phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt.
Hoà loóng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch nước nhận được với cỏc dung mụi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Cỏc
dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đú được cất loại kiệt dung mụi dưới ỏp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được cỏc phần chiết tương ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và
AP3 (phần chiết etyl axetat).
Quy trỡnh điều chế cỏc phần chiết được nờu trờn Sơ đồ 1, Mục 4.2; Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
Xỏc định khối lượng cỏc phần chiết và tớnh hiệu suất so với lượng mẫu khụ ban đầu. Kết quả được trỡnh bày ở Bảng 2.
Bảng 2: Hiệu suất điều chế cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) 1 n-Hexan AP1 21,1 1,32
2 Điclometan AP2 49,2 3,01 3 Etyl axetat AP3 3,8 0,23
3.4 Phõn tớch thành phần cỏc phần chiết bằng phương phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC) lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng silica gel trỏng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) trờn nền nhụm. Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọn trong cỏc hệ dung mụi triển khai khỏc nhau để cho cỏc sắc ký đồ phõn giải tốt cỏc hợp chất trong cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis.
3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1)
Phõn tớch sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện với cỏc hệ dung mụi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC phần chiết n-hexan được trỡnh bày ở Bảng 3, Mục 4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2)
Phần chiết điclometan (AP2) được phõn tớch TLC với cỏc hệ dung mụi
n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC được phần chiết điclometan trỡnh bày trờn Bảng 4, Mục 4.4.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3)
Phần chiết etyl axetat (AP3) được phõn tớch với TLC với cỏc hệ 3 dung mụi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với cỏc tỷ lệ 20:19:1, 20:15:1 và 20:19:0,5, hệ etyl axetat-axit fomic-nước với tỷ lệ 30:2:3, và hệ etyl axetat- metanol-nước với tỷ lệ 30:5:4. Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và FeCl3 5%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC được trỡnh bày trờn Bảng 5, Mục 4.5.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5 Phõn tỏch sắc ký cỏc phần chiết và phõn lập cỏc hợp chất
3.5.1 Phõn tỏch phần chiết n-hexan (AP1)
Phần chiết n-hexan AP1 (10 g) được hoà tan trong CH2Cl2 sau đú được hấp phụ trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm). Khuấy đều cho đến khi silica gel hấp phụ đều hết dung dịch mẫu cho đến khi khụ đều.
Cho silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khớ. Sau đú đổ silica gel ở dạng bột nhóo vào cột sắc ký (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Cho dung mụi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nộn đều cột đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu đó tẩm trờn silica gel lờn cột CC. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng hệ dung mụi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v). Cỏc phõn đoạn được thu theo 50 ml/phõn đoạn. Kiểm tra quỏ trỡnh rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 24 nhúm phõn đoạn được ký hiệu từ AP1.1 đến
AP1.24.
Cỏc nhúm phõn đoạn AP1.11 (150 mg) và AP1.12 (670 mg) được rửa nhiều lần bằng n-hexan cho chất AP1.11 (101 mg) và AP1.12 (203 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Nhúm phõn đoạn AP1.15 (44 mg) được rửa bằng n-hexan cho chất
AP1.15 (25 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu trắng nhạt.
Nhúm phõn đoạn AP1.18 (1,1 g) được phõn tỏch sắc ký CC (2 cm i.d. x 20 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm) với hệ dung mụi gradient n-
hexan-axeton 6:1 đến 1:1 cho chất AP1.18.3 (321 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu vàng nhạt.
Nhúm phõn đoạn AP1.20 (1,13 g) được cho chạy sắc ký cột CC (2 cm i.d. x 25 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm), hệ dung mụi gradient
n-hexan-axeton 7:1 và 5:1 cho năm nhúm phõn đoạn chớnh sau cỏc phõn tớch TLC từ AP1.20.1 đến AP1.20.5. Cỏc nhúm phõn đoạn AP1.20.3 và AP1.20.4
được gộp lại và phõn tỏch CC (2 cm i.d. x 20 cm) với gradient n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1 (silica gel Merck cỡ hạt 40-63 àm). Kết quả thu được chất
AP1.20.3.2 (356 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu vàng ỏnh.
Nhúm phõn đoạn AP1.22 (190 mg) được rửa bằng axeton cho chất
AP1.22 (23 mg)dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Phần chiết điclometan AP2 (4,1 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ CH2Cl2 và được tẩm trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) cho một hỗn hợp bột mịn màu vàng.
Nhồi cột ướt silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm) vào cột phõn tỏch CC (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa phần chiết tẩm silica gel lờn cột, rửa giải gradient bằng hệ dung mụi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v), thu cỏc phõn đoạn theo 50 ml/phõn đoạn. Kiểm tra quỏ trỡnh phõn tỏch bằng TLC. Kết quả thu được 21 nhúm phõn đoạn được ký hiệu từ AP2.1 đến AP2.21.
Nhúm phõn đoạn AP2.11 (200 mg) ở dạng gel được chạy CC (2 cm i.d. x 20 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm) với hệ dung mụi n-hexan- axeton 6:1, thu được chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp
AP2.11.3 với cột CC (1,5 cm i.d. x 20 cm) với hệ điclometan-axeton 25:1, thu được chất AP2.11.3.3 (83 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Nhúm phõn đoạn AP2.16 (150 mg) được kết tinh trong hệ dung mụi n-
hexan-axeton cho chất AP2.16 (135 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu vàng.
Nhúm phõn đoạn AP2.17 (18,7mg) và AP2.18 (18,7mg) được rửa bằng CH2Cl2 cho cỏc chất AP2.17 (15,6 mg) và AP2.18 (3,1 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
3.5.3 Phõn tỏch phần chiết etyl axetat (AP3)
Phần chiết etyl axetat AP3 (3,8 g) được hoà tan vừa đủ trong metanol và được tẩm với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm) cho một chất bột mịn màu vàng.
Nhồi silica gel theo phương phỏp nhồi cột ướt vào cột tỏch CC (Φ = 2,5 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm.
Đưa mẫu tẩm silica gel lờn cột, rửa giải gradient bằng hệ 3 dung mụi
n-hexan-etyl axetat-axit fomic, thu cỏc phõn đoạn theo 20 ml/phõn đoạn cho 13 nhúm phõn đoạn chớnh được ký hiệu từ AP3.1 đến AP3.13.
Chất AP3.4 (87 mg) được tỏch ra từ nhúm phõn đoạn AP3.4 (96 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu vàng.
Nhúm phõn đoạn AP3.13 (0,67 g) được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 (63 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của cỏc hợp chất được phõn lập
β-Sitosterol (AP1.11)
Bột vụ định hỡnh màu trắng.
Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v). Hiện màu tớm với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%. IR (KBr): υmax cm-1 3427, 1637, 1461, 1379, 1056.
6β-Hiđroxistigmast-4-en-3-on (AP1.15)
Tinh thể hỡnh kim màu trắng, đ.n.c. 200-202oC. Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v).
Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 428 (M+., C29H48O2, 37,8), 413 (6,7), 227 (18,5), 152 (57,9), 81 (41,2), 69 (45,4), 55 (100). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 0,74 (3H, s, H3-18), 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-26), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, H3-27), 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz, H3-29), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H3-21), 1,38 (3H, s, H3-19), 2,37 (1H, dt, J = 17,0 Hz, 3,0 Hz, H-2a), 2,51 (1H, ddd, J = 17,0 Hz, 15,0 Hz, 5,0 Hz, H-2b), 4,35 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 2,0 Hz, H-6), 5,81 (1H, s, H-4).
13C-NMR/DEPT (125 MHz, CDCl3, ppm): δ 11,9 (q, C-18), 12,0 (q, C-29), 18,7 (q, C-21), 19,1 (q, C-26), 19,5 (q, C-27), 19,8 (q, C-19), 20,9 (t, C-11), 23,1 (t, C-28), 24,2 (t, C-15), 26,1 (t, C-23), 28,2 (t, C-16), 29,2 (d, C-25), 29,8 (d, C-8), 33,9 (t, C-22), 34,3 (t, C-7), 36,1 (d, C-20), 37,1 (t, C-1), 38,0 (s, C-10), 38,6 (t, C-2), 39,6 (t, C-12), 42,5 (s, C-13), 45,9 (d, C-24), 53,7 (d, C-9), 55,9 (d,C-17), 56,1 (d, C-14), 73,3 (d, C-6), 126,3 (d, C-4), 168,6 (s, C-5), 200,2 (s, C-3).
trans-3S,5S-Đihidroxi-1,7-điphenyl-1-hepten (AP1.18.3)
Tinh thể hỡnh kim màu vàng nhạt, đ.n.c. 75-77oC. Rf = 0,23 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 4:1, v/v). Hiện màu xanh lam với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 282, (M+., C19H22O2, <1), 264 (10,1), 135 (21), 133 (37,8), 104 (68,9), 91 (100), 77 (27,3), 55 (36,1). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ 1,7-1,9 (4H, m, 2H-4, 2H-6), 2,67-2,83 (2H, m, 2H-7), 2,83 (1H, brs, OH), 2,95 (1H, brs, OH), 3,96 (1H, quintet, J = 6,5 Hz, H-5), 4,54 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-3), 6,21 (1H, dd, J = 6,5 Hz, 16 Hz, H-2), 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1), 7,17-7,37 (10H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′, H-6′, H-2′′, H-3′′, H-4′′, H5′′, H-6′′). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm ): δ 31,7 (t, C-7), 39,7 (t, C-6), 43,5 (t, C-4), 71,6 (d, C-5), 73,6 (d, C-3), 125,9 (d, C-4′), 126,5 (d, C-2′, C-6’′), 127,8 (d, C-4′′), 128,4 (d, C-3′, C-5′), 128,5 (d, C-3′′, C-5′′), 128,6 (d, C-2′′, C-6′′), 130,2 (d, C-2), 131,9 (d, C-1), 136,6 (s, C-1′′), 141,9 (s, C-1′).
Alpinentin (AP1.22 = AP3.13)
Bột vụ định hỡnh màu trắng.
Rf = 0,21 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc-HCOOH 15:15:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (26,9), 193 (54,5), 166 (100), 138 (56,3), 123 (19,3), 104 (54,7), 77 (28,3).
Cardamomin (AP3.4 = AP1.20.3.2 = AP2.16)
Bột vụ định hỡnh màu vàng.
Rf = 0,14 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v/v).
Hiện màu vàng chanh với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 270 (M+., C16H14O4, 63,9), 269 (54,7), 193 (100), 167 (34,4), 152 (46,8), 138 (15,1), 124 (12,8), 103 (31,1), 77 (45,4), 69 (37,8). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 3,88 (3H, s, 6′-CH3), 5,93 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3′), 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5′), 7,42-7,48 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,65 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hα), 7,71 (2H, dd, J = 8,0 Hz, 2,5 Hz, H-2, H-6), 7,82 (1H, d, J = 16,0 Hz, Hβ), 13,7 (1H, s, 5-OH).
13C-NMR/DEPT (DMSO-d6): δ 55,9 (q, 6′-OCH3), 91,7 (d, C-3′), 95,8 (d, C-5′), 127,5 (d, Cα), 128,2 (d, C-2, C-6), 128,9 (d, C-3, C-5), 130,1 (d, C-4), 134,9 (s, C-1), 141,6 (d, C-8), 162,6 (s, C-6′), 164,9 (s, C-4′), 166,1 (s, C-2′), 191,6 (C=O).
β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (AP2.18)
Bột vụ định hỡnh màu trắng.
Rf = 0,55 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 1:1, v/v). Hiện màu vàng với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.
EI-MS: m/z (%) 414 (46,7), 396 (68,0), 381 (20,7), 329 (23,3), 303 (27,3), 255 (29,3), 213 (33,3), 145 (41,3), 135 (100), 107 (41,3).
Phản ứng được tiến hành theo phương phỏp của S. G. Olga và cộng sự (2003). Dựa trờn nguyờn tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazin (DPPH ) cú khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bóo hũa. Khi cho cỏc chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất cú khả năng quột cỏc gốc tự do sẽ cú khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ỏnh sỏng của cỏc gốc tự do DPPH. Hoạt tớnh chống oxi húa được đỏnh giỏ thụng qua giỏ trị hấp thụ ỏnh sỏng của dung dịch thử nghiệm so với đối chứng, khi đọc trờn mỏy Elisa ở bước súng λ = 515 nm. Cỏc mẫu cú hoạt tớnh quột gốc tự do SC ≥ 50% sẽ được thử nghiệm để xỏc định giỏ trị SC50.
Xỏc định giỏ trị SC50 (μg/ml);
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giỏ trị SC50 được xỏc định bằng chương trỡnh Table Curve thụng qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đú 50% cỏc gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hũa bởi chất khử.
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đối tượng nghiờn cứu
Thõn rễ tươi cõy Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (T. L. Wu et S. J Chen) (Zingiberaceae) đó được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bỡnh (Viện Sinh thỏi và Tài nguyờn sinh vật, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam) thu thập vào thỏng 11 năm 2007 ở xó Liờm Phỳ, Văn Bàn, Lào Cai.
Mẫu tươi được xử lý và được sấy khụ ở 40oC, sau đú nghiền nhỏ thành bột mịn.
4.2 Điều chế cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
Phương phỏp chiết cú ảnh hưởng rất lớn đến việc phõn tỏch lớp chất. Trong nghiờn cứu này, một quy trỡnh chiết chọn lọc với cỏc dung mụi cú độ phõn cực tăng dần đó được xõy dựng.
Mẫu sấy khụ được nghiền nhỏ và ngõm chiết với dung mụi axeton ở nhiệt độ phũng (4 lần, mỗi lần trong ba ngày). Dịch chiết axeton nhận được sau khi cất loại dung mụi được pha với nước cất và chiết lần lượt được với n- hexan, điclometan và etyl axetat. Cất loại kiệt dung mụi cỏc dịch chiết, ta thu được cỏc phần chiết tương ứng, kớ hiệu là AP1, AP2 và AP3.
Quy trỡnh điều chế cỏc phần chiết n-hexan (AP1), điclometan (AP2) và etyl axetat (AP3) được nờu trờn Sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Quy trỡnh chiết cỏc hợp chất hữu cơ từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
Dịch nước Phần chiết n-hexan
(AP1, 21,1 g, 1,32%)
Phần chiết etyl axetat (AP3, 3,8 g, 0,23%) Phần chiết điclometan (AP2, 49,2 g, 3,01%) Bột khụ xay mịn (1,6 kg) Dịch nước
1. Chiết với etyl axetat 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại etyl axetat 1. Chiết bằng n-hexan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại n-hexan 1. Chiết bằng điclometan 2. Làm khan bằng Na2SO4 3. Lọc loại bỏ Na2SO4 4. Cất loại điclometan 1. Phơi khụ, sấy ở 45-50oC 2. Xay thành bột mịn
1. Ngõm chiết với axeton ở nhiệt độ phũng 2. Cất loại axeton dưới ỏp suất giảm 3. Hoà phần chiết axeton bằng nước cất
Thõn rễ tươi (20 kg)
4.3 Nghiờn cứu thành phần húa học của phần chiết n-hexan (AP1)
4.3.1 Phõn tớch phần chiết n-hexan(AP1)
Phõn tớch TLC sử dụng bản mỏng trỏng sẵn silica gel DC Alufolien 60 F254 (Merck), hệ dung mụi n-hexan-axeton. Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Kết quả phõn tớch TLC với cỏc hệ dung mụi phõn giải tốt được trỡnh bày ở Bảng 3.
Bảng 3: Phõn tớch TLC phần chiết n-hexan (AP1)
Hệ dung mụi
n-hexan-axeton STT Rf Dạng vệt Hiện màu
19:1 1 0,81 trũn xanh 2 0,23 trũn tớm 9:1 1 0,95 dẹp tớm 2 0,88 dẹp xanh 3 0,33 trũn to tớm 4 0,06 trũn nhỏ vàng 6:1 1 0,98 dẹp tớm 2 0,94 trũn to xanh nhạt 3 0,60 trũn nhỏ tớm 4 0,50 trũn tớm 5 0,33 trũn tớm 6 0,15 trũn vàng 3:1 1 0,95 dẹp tớm 2 0,88 dẹp xanh nhạt 3 0,66 trũn tớm 4 0,55 trũn tớm 5 0,44 trũn cam 6 0,40 trũn xanh 7 0,32 trũn vàng 8 0,20 trũn tớm nhạt 1:1 1 0,92 dẹp tớm 2 0,90 dẹp xanh 3 0,60 trũn tớm
4.3.2 Phõn tỏch phần chiết n-hexan(AP1)
Phần chiết n-hexan (AP1) được phõn tỏch bằng sắc ký cột (CC) gradient trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) với cỏc hệ dung mụi rửa