DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1. Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).

Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thƣớc khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. 5554).

Bảng 2.1: Các hệ dung môi triển khai SKLM:

STT Hệ dung môi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu

1 n-Hexan - EtOAc (8: 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4: 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2: 1) hệ C 4 Cloroform - metanol (9: 1) hệ D 5 Cloroform - metanol (5: 1) hệ E 6 Cloroform - metanol (3: 1) hệ F

Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100oC, để phát hiện các hợp chất.

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thƣờng sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm).

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200.

- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) dƣới dạng viên nén KBr.

- Phổ khối lƣợng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Khoa học và Công nghệ Việt nam) ion hóa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD.

- Phổ 1

H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6.

2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ

2.3.1. Thu nhận các dịch chiết

Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khô, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đó, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung môi ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc các cặn tƣơng ứng. Đem cân để xác định khối lƣợng các cặn. Việc thu nhận các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) xem sơ đồ 2.1.

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) MÉu kh« nghiÒn nhá 1,2 kg CÆn n-Hexan Cof H: 80g B· 1 CÆn EtOAc Cof E: 42,3 g B· 2 B· 3 (Bá) n-Hexan(5x5l) C« kh« EtOAc 5x5l C« kh« MeOH5x5l C« kh« CÆn MeOH Cof M: 92,7g

Cặn đƣợc làm khô đến khối lƣợng không đổi và cân xác định trọng lƣợng. Từ lá cây Cà phê chè đã thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là:

Cof H, Cof E, Cof M Ở đó: Cof H : Cặn chiết n-Hexan

Cof E : Cặn chiết EtOAc Cof M : Cặn chiết MeOH

Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hoàng Quế, Đông Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1

Bảng 2.2: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) Mẫu thu vào tháng 12/2008 Khối lƣợng mẫu khô (g) (% so với trọng lƣợng khô)

Khối lƣợng cặn chiết khô (g) n-Hexan (% so với trọng lƣợng khô) EtOAc (% so với trọng lƣợng khô) MeOH (% so với trọng lƣợng khô) Lá 1200 (11,43%) 80,0 (6,67%) ( Cof H) 42,3 (3,53%) ( Cof E) 92,7 (7,73%) (Cof M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00

C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dƣơng tính.

2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit.

Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tính.

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính.

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với các flavonoit.

2.3.2.4. Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tính.

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dƣơng tính đối với cumarin.

2.3.2.5. Định tính các glucosit tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1.

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tính với vòng butenolit.

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ

1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.

2.3.2.6. Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dƣơng tính.

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc nêu trong bảng 2.2.

Bảng 2.3: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica)

STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Cặn

tổng 1 Sterol Lieberman-Bourchardt Màu xanh

Màu vàng +

2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam +

3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt _ H2SO4 đặc Hồng nhạt _ NaOH đặc Vàng _ FeCl3 5% Xanh thẫm _

4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa _ 5 Glucosit trợ

tim

FeCl3 trong CH3COOH

+H2SO4đ Vàng nâu rõ ─

6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong

NaOH +

Chú giải: + : Phản ứng dƣơng tính ─ : Phản ứng âm tính

2.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity)

* Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở ngƣời gồm các nhóm: - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa(Pa) ATCC 15442.

Escherichia coli (Ec)ATCC 25922, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus(Sa) ATCC 13709. Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633

Lactobasillus fermentun N4,

Enterococus faecium B650

- Nấm men: Candida albicans (Ca) ATCC10231. * Môi trƣờng nuôi cấy.

MHB (Mueller - Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar)cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm

* Pha loãng mẫu thử.

- Mẫu ban đầu đƣợc pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử.

- Mẫu ban đầu có nồng độ 40mg/ml đƣợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 256 μg/ml, 64μg/ml, 16μg/ml; 4μg/ml, 1μg/ml.

* Thử hoạt tính các cặn.

- Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.10cfu/ml khi tiến hành thử.

- Lấy 10μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã đƣợc pha loãng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thƣờng. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính toán dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data.

+ Thử định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn.

+ Các mẫu cho hoạt tính (+) ở bƣớc 1 sẽ đƣợc tiến hành thử tiếp bƣớc 2 để tính ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phƣơng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampicilin, Tetracylin, Amphoterixin B và Nystatin.

Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica)

STT Tên mẫu

Tên chủng vi sinh vật kiểm định

ChủngVSV vi Gram dƣơng Chủng VSV Gram âm Nấm men

Staphylococcus aureus IC50(g/ml) Bacillus subtilis IC50(g/ml) Escherichia coli IC50 (g/ml) Pseudomonas aeruginosa IC50 (g/ml) Candida albicans IC50 (g/ml) 1 Cof H > 256 >256 >256 >256 >256 2 Cof E > 256 >256 >256 >256 >256 3 Cof M > 256 >256 >256 >256 >256

Nhận xét: Các mẫu thử không có tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên.

2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT

2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan (Cof H)

Lấy 45 g cặn n-hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan-etylaxetat có tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% etylaxetat. Dịch rửa giải đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc dồn làm một rồi đem cất loại dung môi. Sau đó để yên dịch cô ở nhiệt độ phòng cho tự kết

tinh, các chất kết tinh thể thu đƣợc tiếp tục cho kết tinh lại bằng dung môi thích hợp để nhận đƣợc chất tinh khiết (sạch) và ghi các loại phổ để xác định cấu trúc hoá học, các chất thu đƣợc nhƣ sau:

2.4.1.1. Ancol mạch dài E4C (hexatriacontan-1-ol)

Chạy sắc ký cột 45 g cặn Cof H bằng dung môi n - hexan thu đƣợc khối chất rắn, kết tinh là những tinh thể hình kim, không màu, có khối lƣợng 7,7 mg (0,0257%), kiểm tra SKLM trong hệ dung môi chloroform: metanol (9:1) (Hệ D) hiện màu bằng hơi I2 thấy có 1 vết tròn trên bản mỏng . Xác định Rfx100= 81, nóng chảy ở 88 - 89 C. Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 3.64 (t, 2H1), 1.55 (m, 2H2), 1.28 (H3-35, br), 0.88 (t, 3H36). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 63.12 (t, C1), 32.83 (t, C2), 31,93 (t, C34 ), 29.62(br, C3-32), 25.75(t, C3 ), 22.69(t, C35 ), 14.11 (q, C36). 2.4.1.2. -Sitosterol

Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan/etylaxetat (20:1), thu đƣợc khối chất rắn vô định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu đƣợc những tinh thể hình kim, không màu, có khối lƣợng 23mg (0,051%), Rfx100=50, nóng chảy ở 135-136C.

Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm-1): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3): (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18).

Phổ 13 C -NMR (125MHz, CDCl3):  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.1.3. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol .

Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan:etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung môi, cặn thu đƣợc kiểm tra SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi n-hexan thu dƣợc 19 mg (0,042%) tinh thể hình kim, không màu, không mùi, Rf100 = 64, nóng chảy ở 155-1570

C, []25D = - 430 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr): νmax(cm-1):3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS (m/z (%): 412[M+ ](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5.35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5.14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5.03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3.49 (1H, m, H-3). Phổ 13 C -NMR (125MHz, CDCl3),  (ppm): 36.5 (t, C-1); 29.67 (t, C-2); 71.8 (d, C-3); 42.25 (t, C-4); 140.71 (s, C-5); 121.67 (d, C-6); 37.21 (t, C-7); 31.84 (d, C-8); 51.2 (d, C-9); 36.11 (s, C-10); 24.32 (t, C-11); 42.17 (t, C-12); 31.6 (s, C-13); 56.83 (d, C-14); 25.38 (t, C-15); 31.6 (t, C-16); 55.9 (d, C-17); 12.01 (q, C-18); 18.95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21.03 (q, C-21); 138.3 (d, C-22); 129.3 (d, C-23); 50.01 (d, C-24); 33.9 (t, C-25); 21.19 (q, C-26); 19.79 (d, C-27); 28.89 (q, C-28); 12.22 (q, C-29). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat.

Lấy 30 g cặn etylaxetat đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform: metanol có tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% metanol. Dịch rửa thoát ra từ cột đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% xấy ở nhiệt độ > 100 0C, sau đó các phân đoạn giống nhau đƣợc gộp lại một và đuổi kiệt dung môi.

2.4.2.1. Tritecpen (COF18E3).

Rửa giải cột bằng dung môi chlorofom, cất loại dung môi, thu đƣợc khối chất rắn, kiểm tra SKLM trong hệ dung môi chlorofom: metanol (9:1) thấy chất rắn có hai chất là thành phần chính. Phân tích tiếp bằng cột nhỏ bắt đầu từ hệ hexan: etylaxetat (5:1), (3:1), (2:1), (1:1), etyl axetat, chloroform, chloroform: metanol (9:1), (7:1), (5:1), (3:1), (1:1) và MeOH đã thu đƣợc hai nhóm chất rắn là tinh thể hình kim, không màu trong dung môi chloroform . Nhóm I kí hiệu là COF18E3 có khối lƣợng 118,7 mg (0,394%), nhóm II kí hiệu là COF.Anc, khi phân tích cặn Cof M cũng thu đƣợc COF.Anc có tổng khối lƣợng 520,7mg (1,74%). Kiểm tra SKLM với 18E3 trong hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin thấy một vệt tròn màu hồng trên bản mỏng, Rfx100 = 62, nóng chảy ở 258 - 259 o

C.

IR: (ν cm-1); 3440,3 (OH); 2930,19-2873,52 (C-H: metyl, metylen, metin); 1691,09 (C=O), ...

ESI-MS, m/z: 457,36 [M++H], 1

H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi (CDCl3 + CD3OD): H1 (1,7); H2 (1,55); H3 (3,15); H5 (0,69); H6 (1,3 và 1,49); H7 (1,3); H9 (1,93); H11 (1,8); H12 (5,2); H15 (1,82); H16 (1,93); H18 (2.16); H19 (1,65); H20 (1,65); H21 (1,9); H22 (1,72); H23 (1,05); H24 (0,7); H25 (0,8); H26 (0,9); H27 (0,7); H29 (0,85); H30 (1,1).

13

C-NMR: 125 Mhz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi (CDCl3 + CD3OD): C1 (t, 38,8); C2 (t, 27); C3 (d, 79); C4 (s, 38,7); C5 (d, 55.3); C6 (t, 18,8); C7 (t, 33,1); C8 (s, 39,6); C9 (d, 47,7); C10 (s, 37,1); C11 (t, 23,4); C12 (d, 125,7); C13 (s, 138,4); C14 (s, 42,2); C15 (t, 28,1); C16 (t, 30,8); C17 (s, 47,9); C18 (d, 52,9); C19 (d, 39,2); C20 (d, 39); C21 (t, 24,3); C22 (t, 36,9); C23 (q, 28,2); C24 (q, 17); C25 (q, 17,1); C26 (q, 21,2); C27 (q, 15,5); C28 (s, 180,7); C29 (q, 15,7); C30 (q, 23,5). 2.4.2.2. 3-O--Sitosteryl-glucopyranosit.

Tiếp tục rửa giải cột bằng dung môi chloroform thu đƣợc khối chất rắn vô định hình, kết tinh lại trong dung môi n-hexan thu đƣợc 16 mg (0,036%), kiểm tra SKLM bằng hệ dung môi CM(9:1) (hệ D) Rfx100=35, nóng chảy ở 279-280 oC. Phổ FT-IR max (cm-1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6]+ (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C- 9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18).

2.4.3. Cặn dịch chiết MeOH

Lấy 45 gam cặn MeOH cho vào axit hoá để PH = 1. Sau đó, lọc qua giấy lọc đƣợc dịch đem kiềm hoá bằng NaHCO3 đến PH = 10 rồi đem chiết với chloroform mỗi lần chiêt 150 ml dịch với 200 ml chloroform, dịch sau khi chiết đem làm khô và cất dƣới áp xuất giảm thấy những tinh thể màu trắng, rửa bằng MeOH đƣợc tinh thể đem xác định nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc cho kết quả giống nhƣ COF.Anc. COF.Anc thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc kí cột khi phân tích cặn Cof E.

Kểm tra SKLM với COF.Anc hệ dung môi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin không hiện màu trên bản mỏng nhƣng dùng hơi I2 thấy có 1 vết tròn. Xác định Rfx100= 84,3 nóng chảy ở 237 - 238 C.

Phổ 1

H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3: