2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các steroit và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhyđric acetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 (đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch thuốc thử Wagner, nếu có nhiều kết tủa là phản ứng dương tính.
Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit
Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính.
Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glycozit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1. Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glycosit tim.
2.3.2.6. Định tính các saponin
Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
2.3.2.7. Định tính các đường khử .
Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, hoà tan trong cồn, dung dịch thu được đem trộn với dung dịch thuốc thử Felinh theo tỉ lệ 1-1, đun sôi 2-3 phút. Nếu có kết tủa da cam của Cu2O thì chứng tỏ có mặt của đường.
Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 . Kết quả định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo
STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Toàn
cây
1 Steroit Lieberman-Bourchard Màu xanh vàng +
2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam -
3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl
Dung dịch nhạt màu dẫn
đến màu đỏ nhạt +
4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6])1% Xanh thẫm +
5 Cumarin Axit và kiềm Có kết tủa +
6 Glycozit tim FeCl3 trong CH3COOH +
H2SO4đ Vàng nâu rõ +
7 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH _
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chú giải : + : Phản ứng dương tính. - : Phản ứng âm tính.
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Thái Nguyên.
Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:
Vi khuẩn: Gr (-) Escherichia coli (thực khuẩn đường ruột).
Vi khuẩn: Gr (+) Staphylococcus auresu (tụ cầu vàng).
Vi khuẩn: Salmonella spp (thương hàn).
Vi khuẩn: Shigella spp (lỵ trực khuẩn).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây xuyên tâm thảo
Dịch chiết
Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch
Escherichia coli. Staphylococcus auresu Salmonella spp Shigella spp Strepto coccus pyogenes ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính Cặn Tổng 18 + 22 + 17 + 20 + 19 + Ghi chú: ĐK : Đường kính Dấu (+): là phản ứng có hoạt tính
Dấu (-) : là phản ứng không có hoạt tính
2.4. Phân lập và tinh chế các chất
Các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng.
Phân lập và tinh chế các chất từ cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n-hexan của cây xuyên tâm thảo chúng tôi đã thu được 4 hợp chất sạch dùng để xác định
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cấu trúc hoá học bao gồm: 1ancol no mạch dài, 1steroit và 2 xanthon. Từ dịch chiết etylaxetat phân lập được 2 xanthon sạch.