Tiến hành pha lỗng mồi từ ống gốc cĩ nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, khơng cĩ sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3.
Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha lỗng khác nhau với kết quả nhƣ sau:
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau
Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Ở Hình A, chúng tơi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm cĩ độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này cĩ hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà cĩ thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tơi chọn ở nồng độ 20 mol.
Ở Hình B, nồng độ 20 mol cĩ vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn cĩ thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tơi chọn nồng độ 20 mol.
4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi
Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tơi
lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12
Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV.
Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm.
(+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm.
Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tơi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 550C cĩ độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 550C , nên chúng tơi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tơi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên.
Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tơi nhận thấy khơng cĩ
sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 540
C -> 580C, ngồi nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 560C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV cĩ sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 540C -> 580C, ngồi nhiệt độ
Nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Tín hiệu sản phẩm (MrNV) ++ +++++ +++ ++ ++ Tín hiệu sản phẩm (XSV) ++ ++++ + + +++ 540 550 560 570 580 M 540 550 560 570 580 XSV MrNV A B
550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 580C sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Từ những nhận xét đĩ, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 550C chỉ tăng 10C (550C - 560C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 560C so với các nhiệt độ cịn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 30
C (550C - 580C) thì mới thấy ở 580C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại trừ nhiệt độ 550C. Điều đĩ cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex.
So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 560C, ta thấy cĩ sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngồi trừ cặp nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều khơng cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex.
Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV.
4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TƠM THU THỰC ĐỊA.
Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tơi tiến hành khảo sát 50 mẫu tơm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL.
Chúng tơi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tơm postlarvae nghi là bệnh trắng đuơi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5.
4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tơm càng xanh.
Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV.
Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính.
Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV.
Giếng 10: mẫu chứng dƣơng.
Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tơm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đĩ cĩ 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3. MrNV XSV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A B 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11
Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tơm càng xanh cịn lại. Các mẫu này khơng thấy cĩ biểu hiện của bệnh trắng đuơi.
4.6: Kết quả điện di mẫu tơm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu).
Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng.
Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tơm mẹ mà chúng tơi thu khơng cĩ mẫu tơm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuơi, nên chƣa thể xác định cĩ sự lây bệnh từ tơm mẹ cho đàn ấu trùng hay khơng.
Chúng tơi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tơm postlarvae, tơm mẹ cĩ đƣợc kết quả nhƣ sau:
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
MrNV
XSV 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
Bản g 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR trên 50
mẫu tơm càng xanh
(+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuơi
Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu Kết quả
MrNV XSV 1 -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ - -
31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tơm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - -
43 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tơm mẹ ĐBSCL + - 46 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tơm mẹ ĐBSCL - - 48 Tơm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tơm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tơm mẹ ĐBSCL ++ ++
Tĩm lại trong 50 mẫu mà chúng tơi thực hiện cĩ 7 mẫu tơm nhiễm đồng thời MrNV, XSV và 1 mẫu tơm nhiễm MrNV (giếng 3, hình 4.5). Ở mẫu này ta thấy chỉ cĩ sự hiện diện MrNV khơng cĩ sự hiện diện của XSV. Ở đây chúng tơi đƣa ra hai lý do đƣợc cho là thích hợp để giải thích kết quả này, theo Widada và Bonami (2004), XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên sẽ phụ thuộc vào khả năng sao chép của MrNV rất nhiều, ở mẫu này ta thấy sản phẩm khuếch đại của MrNV là rất yếu chứng
tỏ lƣợng RNA khơng đủ nhiều, điều này chứng tỏ sự hiện diện MrNV trong mẫu bệnh là khơng cao, trong khi XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên lƣợng RNA
của XSV sẽ ít hơn lƣợng RNA của MrNV rất nhiều nên khơng đủ sản phẩm khuếch đại đủ để thấy trên bảng điện di. Hoặc do thao tác tách chiết khơng đƣợc tốt nên chỉ phát hiện MrNV trong mẫu bệnh. Tuy nhiên kết quả này chỉ giải thích cho một mẫu
bệnh trong khi mối quan hệ của MrNV và XSV vẫn chƣa đƣợc biết nên cần phải cĩ
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Cả hai phƣơng pháp tách chiết bằng bộ Kit và Trizol đều cho kết quả tƣơng thích nhau.
Phát hiện đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV, XSV nhiễm trên những mẫu tơm
mẹ bệnh trắng đuơi thu tại ĐBSCL và một mẫu tơm postlarvae thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức.
Thử nghiệm thành cơng kỹ thuật Single - Step RT - PCR của Widada, Sahul Hameed và cộng sự với điều kiện hố chất tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Cảnh Báo Mơi Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II:
Nồng độ Mg2+ là 1,5 mM.
Nồng độ mồi 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV. Nhiệt độ lai 550C.
Ngồi ra chúng tơi cĩ thử nhiệt độ lai tạo cDNA ở 460C và thử nồng độ Mg2+ là 2 mM. Thì thấy ở nồng độ Mg2+ 2 mM làm cho Taq - polymerase hoạt động mạnh tạo ra sản phẩm khơng chuyên biệt và sản phẩm chính khơng thấy rõ, cịn ở nhiệt độ lai tạo cDNA 460C thì thấy sản phẩm khơng đặc hiệu, do nhiệt độ lai khơng đúng làm cho các mồi bắt cặp với RNA khơng chuyên biệt. Do đĩ nhiệt độ lai tạo cDNA và nồng độ Mg2+ là một những nhân tố quan trọng cần đƣợc khảo sát thêm nếu phản ứng chƣa đạt tối ƣu.
Trong quá trình thực hiện phản ứng RT - PCR chúng tơi phát hiện tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tơm bệnh trắng đuơi là rất cao.
Cĩ thể khẳng định cĩ sự hiện của hai virus gây bệnh trắng đuơi trên tơm càng đã xuất hiện tại Việt Nam.
5.2. Tồn tại
Chƣa xác định đƣợc cĩ hay khơng sự lây nhiễm từ tơm mẹ bị bệnh trắng đuơi cho đàn ấu trùng.
Chƣa phát hiện đƣợc sự hiện diện của hai virus MrNV và XSV trên giai đoạn ấu
Số lƣợng mẫu bệnh ít nên chƣa thể khẳng định tần xuất hiện diện MrNV và XSV
trong những mẫu tơm bệnh trắng đuơi là cao hay khơng.
5.3. Đề xuất
Trong phạm vi của đề tài, chúng tơi thu đƣợc một số kết quả nhất định và mở ra một số vấn đề nghiên cứu sâu hơn. Do đĩ chúng tơi cĩ một số đề nghị:
Phát triển kỹ thuật multiplex để phát hiện đồng thời hai virus MrNV và
XSV.
Ở nhiệt độ 550C là nhiệt độ lai tối ƣu cho cả hai virus, điều này rất thuận lợi phát triển kỹ thuật multiplex. Tuy nhiên khi sử dụng cùng một nhiệt độ tối ƣu cho cả hai virus sẽ cĩ hiện tƣợng cạnh tranh mồi. Vì vậy tơi đề nghị cần khảo sát dãy nhiệt độ lai lớn hơn để tìm nhiệt độ lai tối ƣu riêng của từng virus, ở nhiệt độ lai tối ƣu của
MrNV chỉ cĩ mồi của MrNV bắt cặp, ở nhiệt độ lai tối ƣu của XSV chỉ cĩ mồi của
XSV bắt cặp. Sau đĩ đƣa thêm nhiệt độ lai tối ƣu của mồi MrNV là một chu kỳ, và
nhiệt độ lai tối ƣu của mồi XSV là một chu kỳ. Mục đích của việc này là phát kỹ thuật multiplex và để tránh hiện tƣợng cạnh tranh giữa hai cặp mồi, nếu thành cơng thì so sánh giữa hai phƣơng pháp, phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ tối ƣu chung cho cả hai virus là 550C và phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ lai tối ƣu của từng mồi, để xác định phƣơng pháp nào tối ƣu nhất cho việc phát hiện đồng thời MrNV và XSV.
Cần phải cĩ cảm nhiễm trên tơm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau để xem sự hiện của virus xuất hiện nhiều ở giai đoạn nào.
Cảm nhiễm trên tơm mẹ, sau lấy chân bơi tơm mẹ để kiểm tra bằng qui trình Single - Step RT - PCR để xác định cĩ sự hiện diện của virus hay khơng, nếu tơm mẹ bị nhiễm, ta cho tơm mẹ đẻ ra đàn ấu trùng, sau đĩ kiểm tra đàn ấu trùng xem cĩ sự hiện diện của virus hay khơng.
Cần tách riêng hai virus MrNV và XSV, sau đĩ thực hai lơ thí nghiệm, một lơ cảm nhiễm MrNV và một lơ cảm nhiễm đồng thời cả hai virus MrNV và XSV, các thí nghiệm này đƣợc tiến hành trên tơm thịt. Việc tiến hành thí nghiệm này với mục đích xác định vai trị của XSV nhƣ thế nào trong bệnh trắng đuơi.
Cần cĩ bƣớc giải trình tự của hai virus MrNV và XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus ở Việt Nam cĩ sự đột biến hay giống hồn tồn với sản phẩm PCR từ mẫu đối chứng dƣơng từ Ấn Độ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục.
2. Trần Ngọc Hải và ctv, 2000. Hiện trạng triển vọng và giải pháp phát triển
sản xuất giống tơm càng xanh ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Viện Hải
Sản, Đại Học Cần Thơ.
3. Trần Thanh Phục, 2001. Cải tiến cơng nghệ sản xuất, hạ giá thành con giống tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. BCKH. 50 trang.
4. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tơm càng xanh. NXB Nơng nghiệp. 67 trang.
5. Nguyễn Việt Thắng, 1993. Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng quy trình sản xuất giống tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man
(1879) ở đồng bằng Nam Bộ. Luận án PTS khoa học Nơng Nghiệp.Trƣờng Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 175 trang.
6. Nguyễn Việt Thắng, 1997. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật sản xuất giống
tơm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. BCKH.
7. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. ĐH Quốc gia TPHCM. Khoa
Sinh Học - Trƣờng ĐHKHTN.144 trang.
8. Báo Cáo Hội Thảo, 1999. Phát triển nuơi tơm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. An Giang, 5/1999.
9. Bộ Thủy Sản, 2004. Tuyển tập hội Thảo tồn quốc Về Nghiên Cứu Và ứng Dụng Khoa Học Cơng Nghệ Trong Nuơi Trồng Thủy Sản. NXB Nơng
TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI
10. Akiyama D.M ., Brock J.A. and Haley S.R ., 1982. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man.
Veterinary Medicine, Small Clinician: 1119 – 1121
11. Anderson I.G., Nash. and M. Shariff.,1990. Mass larval mortalities in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii De Man, cultured in
Malaysian modified static “green water” systems. Jounal of Fish Diseases 13: 127 – 134
12. Aquacop ., 1977. Macrobrachium rosenbergii De Man Culture Polynesia:
progress in the developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. Proceedings of the World Mariculture Society 8: 311 - 326.
13. Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R ., Mari J ., Bonami, J.R ., 1999. A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 38: 177 - 181.
14. Ban N ., Larson S. B. and McPherson A. (1995). Structural comparison of the plant satellite viruses. Virology 214: 571 - 583.
15. Bespalova I.N ., Adkins S. and Burmeidter M ., 1998. 3’- Race Skewed Ratio of specific to general PCR primers improves yield and specificity.
Biotechniques 24: 375 - 577.
16. Bonami J.R ., Shi Z ., Qian D. and Widada J.S ., 2005. White tail disease of