Dụng cụ và thiết bị Hóa chất và vật liệu
- Bình hút ẩm - Methanol 100% - Epffendorf 1,5 ml - Nutrient - Micropipette 1000µl - Agar - Bếp điện - Tấm sắc ký - Máy ly tâm Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Nhiều vi khuẩn có sắc tố vàng thƣờng đƣợc phân lập từ cây hoặc đất.
Xanthomonas cũng có sắc tố vàng. Do đó, việc dựa vào màu khuẩn lạc trên môi trƣờng để xác định đó là Xanthomonas thì khó. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn có thể xác định đƣợc
Xanthomonas dựa vào phƣơng pháp sắc ký bản mỏng. Các bƣớc tiến hành:
1. Cấy khuẩn lạc trên môi trƣờng nutrient agar (môi trƣờng không có cacbonhydrate vì sẽ tạo chất nhầy cản trở quá trình sắc ký).
(b)
2. Sau 48 giờ phát triển ở nhiệt độ phòng, cạo sinh khối vi khuẩn cho vào ống típ, thêm 3ml methanol sao cho độ đục của vi khuẩn trong methanol khoảng 1010CFU/ml.
3. Đặt ống típ vào nƣớc đang sôi, cho đến khi màu vàng xuất hiện. 4. Ly tâm 1000 vòng/15 phút loại mảnh vỡ tế bào.
5. Thu dịch nổi, đồng thời làm bay hơi methanol trong dung dịch trong nƣớc ấm 50-60oC cho đến khi mật độ quang học của dịch chiết sắc tố khoảng 0.4 ở 443nm.
6. Nhỏ dịch chiết sắc tố này lên tấm bản mỏng đo sắc tố. Mỗi dòng vi khuẩn là một giếng. mỗi giếng là 25µl (hình 3.1).
7. Đặt tấm sắc ký bản mỏng đã nhỏ sắc tố vào dung dịch methanol. Để cho methanol thẩm thấu lên tấm sắc ký này (hình 3.2).
8. Phát thảo vệt sắc tố màu vàng hiện lên tấm sắc ký. Vệt sắc tố màu vàng có Rf khoảng 0.45 chứng tỏ đó là Xanthomonas.
Hình 3.1 (a) Tấm sắc ký vừa nhỏ Xanthomodin dung dịch sắc tố, (b) Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm. 3.4.4.Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
Hóa chất và vật liệu
- Hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform: izoamyl alcohol (24:1)
- Isopropanol
Vệt sắc tố sau khi nhỏ lên tấm sắc ký
20
- Ethanol 100 % và 70 % - Dung dịch đệm ly trích DNA
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA
EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : tạo phức Mg++, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình tách chiết
SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA
Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác
- 10g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) - 100ml NaCl 0,5 M Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8 Bảng 3.1. Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml EDTA 0,5 M 0,5 mM 0,1ml Nƣớc cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để ly trích DNA
- Epffendorf 1,5 ml - Micropipette các loại
- Đầu típ các loại - Bồn ủ nhiệt
- Máy vortex - Máy ly tâm lạnh
- Giấy thấm - Tủ 4oC và - 20oC
Quy trình ly trích DNA tổng số
1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. Rửa sinh khối vi khuẩn đƣợc với 1ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex.
2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30µl dung dịch SDS10%, đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1-2 h.
3. Cho thêm vào 100µl dung dịch NaCl5M hòa tan thật kỹ bằng vortex.
3. Thêm 80µl dung dịch CTAB/NaCl, pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65oC trong 10 phút.
4. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1).Hòa hỗn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4oC. 5. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới.
6. Thêm 780µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4 oC.
7. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol, ủ -20 oC/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4 oC. Lấy kết tủa sau ly tâm.
8. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20 oC, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4 oC. Đổ cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
9. Hòa tan kết tủa trong 40µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4 oC trong suốt thời gian thử nghiệm.
(Sambrook và ctv, 2001 đã có cải tiến)
3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen
Các hóa chất đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR
- Dung dịch đệm PCR 10X (Bio-rad) - MgCl2 50 mM (Bio-rad)
- dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Bio-rad) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad)
- Primer: Xan1330 và Xan332, XACR và XACF
Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng thực hiện phản ứng PCR
- Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2ml
22
- Micropipette 10µl, 100µl và các loại đầu típ tƣơng ứng - Máy luân nhiệt
- Tủ vô trùng
3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005) mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005)
Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’ Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’
Bảng 3.2. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR.cc
3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi
XACF và XACR
Sử dụng bặp mồi XACR, XACF khuếch đại vùng hrpW gen trên Xanthomonas axonopodis pv.citri có kích thƣớc 561bp. Đây là trình tự mồi chuyên biệt để xác định
Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ sau phản ứng Thể tích (µl)
PCR buffer 10X 1X 2,5
dNTPs 25mM 0,2mM 0,2
MgCl2 25 mM 0,75mM 0,75
Primer 20pmol/µl 1,25pmol/µl 1
Taq polymera se 5unit/1µl 2unit/1µl 0,4
DNA <=100ng <=50ng 1
H2O 18,05
Tổng cộng 25
Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ và bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94oC 94oC 58oC 72oC 72oC 3 phút 1phút 45 giây 1 phút 7phút
chính xác 4 dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas axonopodis pv.citri . (theo Dong Suk Park và ctv, 2005). XACF 5’ CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’ XACR 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’ Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR. Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR
Dụng cụ và thiết bị Hóa chất
- Cân kĩ thuật 4 số, ống đong - Agarose
- Lò viba - TAE 0,5X
- Khay đổ gel - Loading dye 6X
- Bồn và máy điện di - Ethidium bromide
- Máy chụp hình gel (Gel doc)
Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ sau phản ứng Thể tích (µl)
PCR buffer 10X 1X 2,5
dNTPs 25mM 0,2mM 0,2
MgCl2 25 mM 1,5mM 1,5
Primer 100pM 10pM 0,25
Taq polymera se 5unit/1µl 2unit/1µl 0,4
DNA <=100ng <=50ng 1
H2O 19,25
Tổng cộng 25
Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ và bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94oC 94oC 60oC 72oC 72oC 5 phút 15giây 30giây 30giây 7phút
24
Bảng 3.6. Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần Thể tích 1 lít
Tris base 2M 242 g
Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml
Quy trình thực hiện
1. Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA
- Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X.
- Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nƣớc thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu.
- Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lƣợc. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp.
- Sau khi gel cứng, di chuyển lƣợc ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.
2. Tiến hành chạy điện di
-Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 5 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.
-Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 250 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).
-Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV thông qua phần mềm Quantity on.
XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi đƣờng cam đƣờng cam
Chúng tôi đã tiến hành phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn trên các cây ký chủ khác nhau và bằng dung dịch KOH 3% đã xác định đƣợc tât cả là gram âm.
Bảng 4.1. Kết quả phân lập và xác đinh gram
Địa điểm thu mẫu Cây ký chủ Dòng vi khuẩn Đặc tính
Tỉnh Đồng Nai Bƣởi Da Láng XBDL1 XBDL2 XBDL3 Gram âm Gram âm Gram âm
Bƣởi đƣờng Cam XBĐC3 Gram âm
4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và Đƣờng Cam Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và Đƣờng Cam
Dòng vi khuẩn PGA YDC
XBDL1 Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL2 Vàng lợt, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBDL3 Vàng, sáp, tròn vun Vàng sữa, sáp, tròn vun XBĐC3 Vàng đậm, sáp, tròn vun Vàng chanh, sáp, tròn vun
26
XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3
Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ.
Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở nhiệt độ 28oC sau 48 giờ.
Dựa vào hình thái của khuẩn lạc có thể thấy rõ 4 dòng vi khuẩn có thể chia 2 nhóm: nhóm XBDL1, XBDL2, XBDL3 có màu sữa trên môi trƣờng YDC và nhóm có màu vàng chanh là XBĐC3. Trên môi trƣờng PGA cũng có sự phân biệt về màu sắc tƣơng tự nhƣng chƣa rõ rệt.
4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo
Tiến hành chủng bốn dòng vi khuẩn trên lá Da Láng. Kết quả là cả bốn dòng đều tạo vết bệnh. (Bảng 4.3)
Dựa trên kết quả chủng bệnh, có thể kết luận:
-Dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 khi chủng trên lá Da Láng tạo vết bệnh rõ chứng tỏ dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng có khả năng gây bệnh.
-Dòng vi khuẩn phân lập trên trái bƣởi Đƣờng Cam khi chủng trên lá Da Láng vẫn có khả năng gây bệnh. Nhƣ vậy, ký sinh và ký chủ chƣa có tính chuyên biệt cao. Để khẳng định chính xác đặc tính này cần phải tiến hành chủng nhân tạo trên nhiều ký chủ khác nhau.
- Khi so sánh vết bệnh chủng trên lá Da Láng giữa hai dòng XBDL2 và XBDL3 dƣới kính hiển vi, độ phóng đại 40 lần nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt. Dòng XBDL2 gây vết bệnh phồng, mọng nƣớc, viền xanh (hình 4.3.(c)) trong khi dòng XBDL3 không phồng, hơi lõm, viền xanh đậm lan ra, gờ nhẹ (hình 4.3.(d)). Điều này chứng tỏ tính độc khi gây bệnh của hai dòng này khác nhau. Để xác định rõ đặc tính này, tiến
Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng vi khuẩn: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 trên lá da láng.
Giống Thời gian xuất hiện bệnh Tổng số đốm bệnh/ Tổng số vết thƣơng Mô tả triệu chứng bằng mắt thƣờng Triệu chứng bệnh qua kính hiển vi (độ phóng đại 4x10)
XBDL1 3 ngày 96% Gờ nhẹ Viền màu xanh, mọng nƣớc, bên trong sùi nhẹ.
XBDL2 2 ngày 95% Gờ nhẹ Viền màu xanh đậm, mọng
nƣớc, bên trong vết bệnh sùi lên cao.
XBDL3 3 ngày 98% Gờ nhẹ Vết bệnh lan rộng, xung
quanh viền màu xanh đậm, bên trong không sùi.
XBĐC3 3 ngày 90% Gờ nhẹ Vết bệnh phồng nhẹ, viền màu
xanh, bên trong không sùi.
Hình.4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng vi khuẩn lên lá non bƣởi Da Láng(a) không chủng vi khuẩn; (b) chủng dòng XBDL1, (c) chủng dòng
(e) (d)
(c)
28
XBDL2; (d) chủng dòng XBDL3; (e) chủng dòng XBĐC3. Tổng số vết thương là 50
4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh
Tiến hành sắc ký bản mỏng trên các dòng: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XTĐC3 và một dòng đối chứng âm là Erwinia sp. Mục đích của chạy sắc ký bản mỏng là để khẳng định các dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas sp.
Kết quả khi chƣa chụp UV: đối chứng âm không ra, dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 đều có vệt màu vàng.
Kết quả khi chụp UV: chỉ có một dòng XBDL1 phát sáng rõ rệt nhất, các dòng XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chỉ có vệt mờ nhƣng giá trị Rf >0.45 theo mục 3.4.3 Rf=0.45 mới khẳng định đƣợc đó là Xanthomonas sp. Nhƣ vậy, dựa vào kết quả sắc ký không thể kết luận dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 là Xanthomonas sp. Để có thể định danh đƣợc bốn dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chúng tôi thực hiện khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005).
Hình 4.4. Kết quả sắc ký : (a) không chụp UV ; (b) chụp UV. (-) dòng Erwinia sp;1 dòng XBDL3;2 dòng XBĐC3; 3 dòng XBDL1; 4 dòngXBDL2
4.4 Ly trích DNA tổng số
Tiến hành ly trích DNA từ 4 dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 đã đƣợc nhân sinh khối. Mỗi dòng tiến hành ly trích 2 lần, kết quả thể hiện ở hình 4.5
Rf=0.5 (a) (-) 1 2 3 4 (b) (-) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
x
Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.4.4 (Sambrook và ctv,2001 đã có cải tiến).
Ghi chú: 1 dòng XBDL1, 2 dòng XBDL2, 3 dòng XBDL3, 4 dòng XBĐC. Nhận xét: Qua hình 4.5 cho thấy quy trình ly trích theo mục 3.4.4 (Sambrook và
ctv, 2001 đã có cải tiến) đã ổn định, nhƣng kết quả chƣa sạch. Ngoài DNA tổng số còn có DNA bị gãy, phần tạp nhiễm trong quá trình ly trích tạo thành vệt sáng cuối giếng. Các dòng XBDL1, XBDL3 là bị tạp nhiễm nhiều nhất. Để thực hiện phản ứng PCR, DNA tổng số phải đƣợc pha loãng xuống.
4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS
Tiến hành phản ứng PCR theo 3.4.5.1 thu đƣợc kết quả nhƣ hình 4.6
Hình 4.6.cho thấy sản phẩm PCR của 4 dòng phân lập đƣợc có cùng kích thƣớc với dòng Xanthomonas sp đã đƣợc phân lập và định danh trên cây cải ngọt. Dòng
1.1kb 1 2 3 4 5
Hình 4.6. Sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS
Ghi chú: 1- sản phẩm PCR của Xanthomonas sp đã được định danh.
sử dụng sản phẩm này như đối chứng dương; 2- sản phẩm PCR của dòng XBDL1
3-sản phẩm PCR của dòng XBDL2 4-sản phẩm PCR của dòng XBDL3 5-sản phẩm PCR của dòng XBĐC3
Xanthomonas sp này đã đƣợc định danh chính xác là Xanthomonas campestris pv.citri
cùng thời gian thực hiện đề tài. Để xác định rõ loài của 4 dòng gây bệnh có 2 phƣơng pháp là giải trình tự hoặc tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên đoạn primer chuyên biệt. Với điều kiện hiện có, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên hrpW gen với cặp primer chuyên biệt là XACR và XACF ( Dong Suk Park và ctv).
4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen
Thực hiện phản ứng theo mục 3.4.5.2 nhƣng kết quả không thành công. Tiếp tục thực hiện phản ứng đồng thời thay đổi nồng độ thành phần nhƣng kết quả vẫn không ra. Do đó, chƣa thể khẳng định 4 dòng phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và bƣởi Đƣờng Cam tại Đồng Nai là Xanthomonas. axonopodis pv. citri.
Nhận xét lý do kết quả không thực hiện đƣợc: -Chất lƣợng DNA mẫu chƣa tốt, còn tạp nhiều. -Nguồn vi khuẩn phân lập còn ít.
Dựa vào kết quả đạt đƣợc có thể rút ra thảo luận: phƣơng pháp sinh học phân tử có thể hổ trợ cho phƣơng pháp định danh bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa. Phƣơng pháp sinh học phân tử cụ thể là phƣơng pháp PCR, giải trình tự có thể định danh ở mức loài, tìm ra loài mới, nghiên cứu đƣợc sự đa dạng di truyền: năm