GAs là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin do những ứng dụng đa dạng của nó đối với sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây trồng như kích thích sự kéo dài của đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và xác định phái tính của hoa (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 136 loại giberelins tiết ra từ vi khuẩn, nấm và thực vật (http://www.plant-hormones.info). Trong đó, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3.Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme được phân lập trên môi trường sản xuất GA3 – 20% ICI trong 7 ngày trên máy lắc 200 vòng/phút/28oC (Stefan Malonek và ctv., 2005). Sau đó tiến hành trích GA3 như Mục 3.4.3 rồi thực hiện TLC theo Mục 3.4.4.
Kết quả nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường 20% ICI tốt, không bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Để kiểm tra giới hạn phát hiện GA3 của chuẩn chúng tôi tiến hành TLC chất chuẩn ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 ppm. Kết quả các chuẩn ở nồng độ 1 và 5 ppm thấy không hiện vết khi quan sát dưới đèn UV, còn các chuẩn 10 và 50 ppm thì hiện vết mờ vì thế chúng tôi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành cùng với mẫu.
Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA của các dòng
Fusarium moniliforme bằng cặp primer ef1-ef2. (1) DNA được khuếch đại từ dòng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18.
Trong 20 mẫu nấm sau khi nuôi cấy, trích GA3 và tiến hành TLC trên hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) chúng tôi nghi ngờ 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 có thể tạo ra GA3 trong môi trường nuôi cấy (Hình 4.10). Các dung dịch nuôi cấy 17 dòng còn lại không hiện vết tại vị trí có Rf tương đương với chuẩn.
Theo Hình 4.10 nhận thấy vết đầu tiên trên bản TLC từ dưới lên của dung dịch nuôi cấy 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, 4 có giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm ở vị trí số 3 (Rf=0,12).
Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng là dung dịch nuôi cấy các dòng nấm FM2, FM5 và FM15. (3) chuẩn GA3 100 ppm.
Tuy nhiên chúng tôi tiến hành trên hệ dung môi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hơn hệ dung môi cũ nhằm khẳng định Rf của các vết từ dung dịch nấm có tương đương với vết chuẩn GA3 hay không. Kết quả thu được Rf của 3 mẫu thấp hơn Rf của chất chuẩn. Ngoài ra dựa vào Hình 4.10, các vết khác ở các mẫu có thể là các giberelins khác do nấm tiết ra trong quá trình nuôi cấy. Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuôi cấy một số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi đã phát hiện sự tồn tại của 25 loại giberelin. Từ những kết quả trên nhận thấy qui trình thực hiện trên 20 dòng nấm không hiệu quả do một số nguyên nhân sau: điều kiện nuôi cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu và nồng độ GA3 trong dung dịch nuôi cấy nấm quá thấp.
Hình 4.10 Kết quả TLC dịch nấm sau khi nuôi cấy các dòng nấm F.moniliforme
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Đã phân lập và tách đơn bào tử được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme
gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Có thể áp dụng qui trình 2 ở Mục 3.3.2.2 để tiến hành ly trích DNA của nấm Fusarium moniliforme.
Qui trình PCR ở mục 3.3.3.2 ổn định cho sản phẩm rõ và không có tạp nên dùng để phân tích PCR trên vùng tef của nấm Fusarium moniliforme. Đã chạy thành công 14/20 dòng nấm được phân lập.
Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC.
5.2 Đề nghị
Tiến hành thí nghiệm chủng nấm in vitro từ đó có thể xác định được dòng nấm có độc tính mạnh nhất có nghĩa là tìm dòng nấm nào tạo nhiều GA3 nhất.
Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR rồi đem kết quả đọc trình tự so sánh với trình tự trên Genbank để có thể xác định rõ loài gây bệnh.
Tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp và quy trình trích giberelin hiệu quả để nấm Gibberella fujikuroi có khả năng sản xuất giberelin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nƣớc
1. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh gây hại cây trồng, quyển 1, cây lương thực, thực phẩm, hoa cảnh. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 123 – 125.
2. Bùi Chí Bửu, Ngyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 331 – 348.
3. Nguyễn Xuân Dũng và Phạm Hùng Việt, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 225 – 297.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA và vùng tef.. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
6. Đào Văn Hoằng, 2005. Kỹ thuật tổng hợp các hóa chất bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội. Trang 317 – 320.
7. Ngô Quang Hưởng, 2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
8. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 82 – 84.
9. Đỗ Thị Di Thiện, 2005. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự ảnh hưởng của cây Hông (Paulownia fortunai) và cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv samsum) nuôi cấy invitro. Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
10.Trần Tùng, 2005. Bệnh hại hạt lúa giống sau khi thu hoạch và ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc hóa học đến tác nhân gây bệnh, chất lượng hạt giống.
11.Nguyễn Kim Phi Phụng. Các phương pháp nhận danh , trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2000 – 2001. Trang 1 – 25. 12.Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà xuất
bản TP.HCM. Trang 18 – 49.
13.Tài liệu qui trình phân tích các hormon thực vật. Phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
2. Tài liệu nƣớc ngoài
14.A.R.Pokalsky, W.R.Hiatt, N.Ridge, R.Rasmussen, C.M.Houck and C.K.Shewmaker, 1989. Structure and expression of elongation factor 1 in tomato.
<http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid =2748335>
15. B.Tudzynski, 1999. Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects. Appl Microbiol Biotechnol 52: 298 – 310.
16.David M. Geiser, María del Mar Jiménez-Gasco, Seogchan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Todd J.Ward, Ning Zhang, Gretchen A. Kuldau and Kerry O‟Donnell, 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00. 17.Hiroshi Harada and Antom Lang, 1964. Effect of some (2-Chloroethyl)
trimethylammonium chloride analogs and other growth retardants on gibberellin biosynthesis in Fusarium moniliforme.
18.Hiroshi Kawaide. Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi.<www.aseanbiodiversity.info/scripts/count_article.asp?Article
_code=51006656>
19. Kamel A. Abd-Elsalam, Ibrahim N. Aly, Mohmed A. Abdel-Satar, Mohmed S. Khalil and Joseph A. Verreet, 2003. PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data. Africa journal of iotechnology vol.2. p82 – 85 .
20. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten wolff and Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi.CRC Press. 322 pages.
21.Lester W. Burgess, Brett A. Summerell, Suzanne Bullock, Kathryn P. Gott, and David Backhouse, 1994. Laboratory manual for Fusarium research. 3rd edition. University of Sydney.
22.Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, 2002. Plant Physiology. 3rd edition. p509 – 540. 23.MacMillan. J and Suter. P.J, 1963. Thin layer chromatography of the gibberellins.
Nature 197: 790.
24.Paul E. Nelson, 1992. Taxonomy and biology of Fusarium moniliforme.
Mycopathologia 117: 29 – 36.
25. Reyes Candau, Javier Avalos and Enrique Cerdá-Olmedo, 1992. Regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi. Plant Physiol 100: 1184 – 1188. 26.S.H.Ou, 1985.Rice diseases. Second edition. Commonwealth mycological institute.
p262 – 272.
27.Stefan Malonek, Christiane Bomke, Erich Bornberg-Bauer, María C. Rojas, Peter Hedden, Paul Hopkins, Bettina Tudzynski, 2005. Distribution of gibberellin biosynthesis genes and gibberellin production in the Gibberella fujikuroi species complex. Phytochemistry 66: 1296 – 1331.
3. Tài liệu internet
28.http://en.wikipedia.org/wiki/Gibberellic_cid. 29.http://www.ctu.edu.vn/coursewares/khoahoc/sinhhocdc_a2/phan1/ch3.htm#II.2. 30.http://beta.uniprot.org/taxonomy/5127. 31.http://www.knowledgebank.irri.org/riceDoctor_MX/projectImages/image1.gif. 32.http://www.planthealthaustralia.com.au/project_documents/uploads/review4.pdf. 33.http://www.wellesley.edu/Chemistry/chem211lab/Orgo_Lab_Manual/Appendix/ Techniques/TLC/thin_layer_chrom.html. 34.http://www.plantsciences.ucdavis.edu/uccerice/NEWS/RiceNL_mar2003.pdf. 35.http://www.laodong.com.vn/Home/kinhte/2007/2/23593.laodong.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Bình sắc ký
Phụ lục 2: Công thức tính Rf
Trong đó:
a: Khoảng đường di chuyển của dung môi. b: Khoảng đường di chuyển của hợp chất.