Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh. Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi.
Dung dịch Davision có thành phần nhƣ sau:
Acid acetic glacial : 115ml Cồn 95% : 330ml Formalin : 200ml Nƣớc cất : 335ml
Hoà tan các thành phần lại với nhau và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Theo FAO (2000), nên ngâm trực tiếp ấu trùng và hậu ấu trùng (Postlarvae) (PL) giai đoạn sớm trong dung dịch cố định với tỉ lệ tối thiểu là 10 thể tích dung dịch cố định với 1 thể tích mô tôm. Thể tích này rất quan trọng trong việc bảo quản mẫu có hiệu quả, việc cố gắng làm giảm tỉ lệ này để giảm chi phí có thể làm cho mẫu mô không đạt yêu cầu cho quá trình đọc mẫu.
3.2.2.2 Xử lý mẫu
Mẫu tôm post sau khi cố định xong tiến hành xử lý mẫu. Mẫu đƣợc lấy ra khỏi dung dịch cố định và tiến hành xử lý mẫu, với sơ đồ nhƣ sau:
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Sau khi xử lý xong tiến hành đúc mẫu.
3.2.2.3 Cách đúc mẫu
Mục đích của việc đúc mẫu là làm cho mẫu tôm đƣợc cố định để có thể cắt với lát mỏng (khoảng 5µm) cho việc quan sát trên kính hiển vi dễ dàng, chính xác không làm thay đổi cấu trúc của các tổ chức tế bào.
Đặt mẫu vào đáy khuôn inox sao cho mặt tiếp xúc của mẫu với đáy khuôn là lớn nhất. Thực hiện bƣớc này tốt thì hình ảnh khối gan tụy và cơ quan mang có diện tích lớn, dễ quan sát cấu trúc mô bên trong.
Rót parafin vào khuôn, cố gắng giữ mẫu sao cho mẫu ở trung tâm khuôn (để khi tiến hành cắt mẫu và quan sát trên kính hiển vi đƣợc tốt hơn), đậy nắp cassette lại.
Đặt khuôn inox lên trên bề măt của dụng cụ làm lạnh, đợi khoảng 15 phút sau tách khối parafin ra đặt trực tiếp lên bàn lạnh.
3.2.2.4 Cách cắt mẫu
Dùng máy cắt microtome, lát cắt có độ dày 5 – 6 micromet.
Lát cắt đƣợc đặt lên lam, cho vài giọt cồn 70% lên, làm căng bề mặt mẫu bằng cách cho qua bể nƣớc ấm khoảng 40oC, sau đó đính mẫu lên lam và đặt vào bàn ấm ở nhiệt độ 40oC trong vòng 4 đến 6 giờ thì tiến hành nhuộm mẫu.
3.2.2.5 Nhuộm mẫu
Theo phƣơng pháp của Sheenhan và Hrapchak (1980), dùng thuốc nhuộm là Haematoxylin và Eosin.
Sơ đồ nhuộm mẫu:
Nhỏ một giọt keo Boume Canada ngay lên trên tiêu bản mẫu và đặt lamel lên, ép sát lame lên lam kính, cố gắng tránh sự hình thành bọt khí bên trong.
3.2.2.6 Quan sát trên kính hiển vi
Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, tiến hành quan sát hình thái cấu tạo tế bào khối gan tụy, cơ quan mang, cơ của mẫu.
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN