2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh
Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm nên phòng là chủ yếu. Biện pháp phòng trừ tổng hợp được dùng rộng rãi trên thế giới.
Lựa chọn post-larvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (mô học, PCR, sốc formalin).
Chẩn đoán chính xác, kịp thời, lập chương trình kiểm soát dịch bệnh đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với WSSV.
Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh:
+ Sử dụng biện pháp thay nước có kiểm soát
+ Mỗi trại phải có hệ thống xử lý nước riêng, nước phải được khử trùng trước khi vào ao nuôi.
+ Chất lượng nước được duy trì ở điều kiện ổn định.
+ Giảm các tác nhân gây stress trong ao nuôi: pH, DO, nhiệt độ, độ mặn, amonia và sản phẩm thải, dư thừa trong ao.
+ Sử dụng một cách chọn lọc các chế phẩm vi sinh (probiotic) để tăng cường sức đề kháng của tôm đối với WSSV.
+ Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng bằng vitamin.
+ Phòng ngừa bệnh lây lan từ trại này sang trại khác.
+ Loại trừ tôm, cua, ruốc xâm nhập vào ao nuôi (lưới lọc, lưới ngăn bờ ao).
+ Có ao trữ nước chiếm 20 - 30% ao nuôi, nước được trữ lắng 7 ngày trước khi dùng
+ Ngăn ngừa và kiểm soát sự lan truyền của bệnh trong cộng đồng.
2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác
Theo Hőstein (2000), mục tiêu chính trong việc phát hiện virus WSSV là nhằm khẳng định có xảy ra bệnh hay không và kiểm tra xem tôm bố mẹ và con giống có mang mầm bệnh hay không.
Để chẩn đoán có hay không có bệnh trong ao phải tiến hành phân tích mô học bằng cách nhuộm mô tôm bằng Hematoxylin và Eosin, sau đó xem dưới kính hiển vi (Hőstein, 2000). Nếu tôm bệnh sẽ quan sát được các thể vùi trong nhân bị trương to của các tế bào biểu mô cutin và tế bào mô liên kết (Lightner, 1996).
Để khẳng định chẩn đoán và xác định tình trạng nhiễm WSSV của nguồn tôm bố mẹ và con giống nên dùng kĩ thuật PCR (Hőstein, 2000). Các kỹ thuật PCR đã được phát triển gồm 1-step, 2-step PCR (Lo và ctv, 1996), one-tube nested PCR (Lo và ctv, 1998).
Ngoài ra cũng có thể chẩn đoán bằng:
Transmission eletron microscopy (TEM). Mặc dù WSSV có thể phát hiện được bằng phương pháp này nhưng kĩ thuật này chủ yếu dùng trong chẩn đoán khẳng định (Lightner, 1996)
In situ DNA hybridisation (cho phép xác định WSSV khi không
có những dấu hiệu mô bệnh học – Chang và ctv, 1996): Xử lý và cố định mô theo phương pháp mô học truyền thống, lai và phát hiện virus WSSV bằng probe có đánh dấu, quan sát dưới kính hiển vi.
Western blot analysis (Nadala và ctv, 1997).
Dot blot (Nadala and Loh, 2000).
Ngoài những phương pháp xác định WSSV dựa trên vật liệu di truyền, các xét nghiệm dựa trên miễn dịch cũng được sử dụng, một trong số đó là phương pháp hóa mô miễn dịch. Từ khi kháng thể đơn dòng nhận diện epitope trên vỏ virus hay trên capsid được sản xuất thành công và xuất hiện test kit hóa mô miễn dịch thương phẩm sử dụng kháng thể đơn dòng, kĩ thuật này càng phát huy được thế mạnh của nó về độ chính xác, độ nhạy và hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm. Trong khoá luận này, dựa vào những điều kiện sẵn có, chúng tôi tiến hành ứng dụng hoá mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú
2.4. Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemmistry) 2.4.1. Lịch sử phát triển
Coons và cộng sự (1941) là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô. Kĩ thuật hoá mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammons, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) và
có thể sử dụng để phát hiện phản ứng hoá mô miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography).
Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC world, 2005).
2.4.2. Nguyên lý
Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu. Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất.
2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen)
Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại).
Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein. Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987).
Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lượng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987).
2.4.4. Kháng thể (antibody)
Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch.
Có hai loại kháng thể (Hình 2.8)
A B
Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002).
A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi
những tế bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên
Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một
dòng tế bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu.
Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh. Phương pháp tạo ra kháng thể này như sau:
Một phần của gen VP28 (VP28F118) được clone vào vector
Chuyển vector vào E. Coli, mục đích là tạo ra một protein
(rVP28F118) thiếu vùng liên màng tận cùng bằng đầu N.
Protein VP28F118 được tinh sạch bằng SDS-FAGE và dùng để gây miễn dịch trên chuột Swiss thu kháng huyết thanh.
Chọn một dòng tế bào plasma từ kháng huyết thanh thu được cho lai với tế bào u tuỷ bằng phương pháp cell fusion. Tế bào lai (hybridoma) tạo thành được dòng hoá. Thu kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 từ dòng tế bào lai này.
Trong bài khóa luận chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 trong phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện mầm bệnh virus WSSV trên tôm sú
Penaeus monodon.
Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể
Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ
và nhiệt độ. Nếu không có những thông tin từ nhà cung cấp kháng thể ta phải chuẩn độ để xác định nồng độ thích hợp nhất cho các chất tham gia phản ứng hóa mô miễn dịch. Kháng thể được pha loãng ở nồng độ thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm. Người ta thường xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố
định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm. Kháng thể đơn dòng có khoảng pI và cấu tạo phân tử giới hạn hơn kháng thể đa dòng nên chúng nhạy cảm hơn với pH và ion trong dung dịch đệm. Vì vậy để ước lượng kháng thể đơn dòng cần chuẩn độ ở pH 6,0 và 8,6 và không có NaCl. Độ pha loãng cao nhất và pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch và ctv, 2002).
Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ
chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn. Tuy nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp trước khi xác định độ pha loãng tối ưu. Nồng độ kháng thể đặc hiệu càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch và ctv, 2002).
Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên –
kháng thể đạt được nhanh ở 370C. Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể. Tuy nhiên không thể biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền.
Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam chúng tôi chọn thử nghiệm một chỉ tiêu quan trọng quyết định kết quả nhuộm là độ pha loãng kháng thể và 1 yếu tố phụ là nồng độ DAB.
2.4.5. Các phƣơng pháp nhuộm
Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005).
Hình 2.9. Các phƣơng pháp nhuộm
A: Phương pháp trực tiếp (direct method).
B: Phương pháp gián tiếp hai bước (two-step indirect method). C: Phương pháp gián tiếp ba bước (three-step indirect method). D: Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan (APAAP)
E: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (ABC).
F: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (LAB hay LSAB).
A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện
như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Vì phương pháp này chỉ dùng một kháng thể nên tiết kiệm thời gian và rất ít phản ứng không đặc hiệu. Tuy nhiên cũng vì phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay (Hình 2.8.A) ( Boenisch và ctv, 2002).
A B Enzyme Khángnguyên Kháng thể 1 Kháng thể 2 Kháng thể 3 Biotin (Strept)avidin Chú thích C D E F
B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể
sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ cùng một loài có thể được sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp. Quy trình này cũng nhạy hơn nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuyếch đại tín hiệu lên nhiều lần vì nhiều enzyme được cố định trên mỗi vị trí đích (Hình 2.8.B) (Boenisch và ctv, 2002).
Thông thường, kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng và kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng.
C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Trong phương pháp này
người ta bổ sung thêm 1 kháng thể đánh dấu enzyme nữa vào phương pháp B. Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tự như hình 2.8.C. Ví dụ như nếu kháng thể thứ cấp thứ 1 tạo ra từ dê, thì kháng thể thứ cấp thứ 2 phải đặc hiệu với globulin miễn dịch của dê. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope (Boenisch và ctv, 2002).
D. Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan: còn được gọi là phương pháp không đánh dấu kháng nguyên. Quá trình nhuộm cần có kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hòa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp miễn dịch được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nó, loại bỏ kết tủa, thu dịch hòa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó.
Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme.
Kĩ thuật này được đặt tên theo phức hợp miễn dịch enzyme sử dụng.Ví dụ: Phương pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase, APAAP (alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) sử dụng phức hợp alkaline phosphatase – kháng alkaline phosphatase. Phức hợp PAP gồm 3 phân tử peroxidase và 2 kháng thể, phức hợp APAAP gồm 2 phân tử alkaline phosphatase và 1 kháng thể (Hình 2.8.D) (Boenisch và ctv, 2002).
E. Kỹ thuật (strept)avidin-biotin: Hầu hết những phương pháp nhuộm ngày nay
đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin. Kỹ thuật này có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin- biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB nhạy hơn phương pháp ABC (Hình 2.8.E, F) (Boenisch và ctv, 2002).
Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB).
2.4.6. Ứng dụng phƣơng pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản
Kể từ khi ra đời phương pháp IHC đã chứng tỏ tính ưu việt trong chẩn đoán bệnh, các thí nghiệm khẳng định trong nhân y (chẩn đoán bệnh ung thư vú, ung thư phổi) (Hayat, 2004), thú y và trong thủy sản hay ứng dụng trên lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về hệ miễn dịch (dùng IHC để phát hiện kháng thể kháng Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa) trong cá bơn Scophthalmus maximus L. (Sitja-Bobadilla và
ctv, 2005)
Đối với thủy sản, xác định nhanh mầm bệnh quyết định tính hiệu quả trong kiểm soát bệnh. Phát hiện mầm bệnh không những quan trọng với cá nhiễm bệnh mà còn với môi trường (giữa thời kì thu hoạch và tái xuống giống) và như là một hệ thống
cảnh báo sớm. Ứng dụng probe kháng thể và probe/primer DNA đã có những ảnh hưởng quan trọng trong phát triển những phương pháp chẩn đoán nhanh mới (Hiney và Smith, 1998).
Phương pháp IHC và một số phương pháp dựa trên kháng thể khác như miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (flourescence antibody tests – FAT), gián tiếp (indirect flourescence antibody tests – IFAT), ELISA (enzyme link immunosorbent assays) được ứng dụng trên nhiều dạng mầm bệnh khác nhau gồm vi khuẩn (Aeromonas
salmonicida, Aeromonas hydrophila, Photobacterium damsela subspecies piscicida, Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp., Vibrio anguillarum và