Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dƣơng Minh Châu và Bến Cầu

Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng

Huyện Số mẫu (+) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%)

Dương Minh Châu 0 35 0

Bến Cầu 0 30 0

Chú thích: (+): Dương tính

Kết quả trên cho thấy tất cả các mẫu đậu phộng thu thập được đều không có biểu hiện dương tính với TSWV (0%).

Đậu phộng trồng tại 2 huyện này có triệu chứng biểu hiện giống như triệu chứng bệnh do TSWV gây ra nhưng không phát hiện được dương tính khi chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, có thể giải thích là do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường.

Qua người dân, chúng tôi biết rằng, nước tưới tiêu tại địa bàn điều tra được lấy từ những giếng đào sâu trong lòng đất, tận dụng mạch nước ngầm là chủ yếu. Thời điểm tiến hành điều tra, thu thập mẫu nhằm vào những tháng tỉnh Tây Ninh đang là mùa khô, thời tiết khá nóng, nắng gay gắt, giếng đào dần cạn nước, đất trồng khô, nứt nẻ, và việc thiếu nước tưới đã xảy ra, nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục.

Đậu phộng trồng tại đây bị thiếu nước lâu ngày nên hình thái cây bị biến đổi: Lá vàng, thân cây rủ xuống. Nắng khá gay gắt và nóng làm cháy lá, đốm lá, gây héo lá, giống như bị hoại tử và lá rụng dần. Các triệu chứng này đã dẫn tới việc lầm tưởng cây đã nhiễm TSWV.

Kết quả này còn chứng tỏ một điều là không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng bên ngoài mà xác định bệnh.

Bên cạnh đó, cũng có khả năng là thật sự TSWV chưa nhiễm trên đậu phộng ở huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu vào thời điểm thu thập mẫu.

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Biên và Bến Cầu

Thể hiện qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.1.

Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với CMV, TMV, TSWV trên thuốc lá

Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Số mẫu (-) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) CMV 26 26 52 50 TMV 29 13 42 69,1 TSWV 0 70 70 0 Chú thích: (+): Dương tính (-): Âm tính 0 10 20 30 40 50 60 70 CMV TMV TSWV Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính Số mẫu điều tra

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dƣơng tính, âm tính với CMV, TMV và TSWV

Sau khi tiến hành chẩn đoán TSWV cho 70 mẫu thuốc lá thu được tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh, không phát hiện được mẫu dương tính với TSWV (0%). Điều này có thể được giải thích bởi 3 lý do sau:

Tại các huyện thu thập mẫu, TSWV vào thời điểm này còn ít, chưa phát tán rộng, nên chưa lấy được đúng mẫu đã nhiễm TSWV.

Do mẫu được lấy chủ yếu dựa theo triệu chứng bên ngoài nên có thể mẫu đã nhiễm các virus khác với TSWV nhưng triệu chứng biểu hiện lại tương tự như nhiễm TSWV.

Số mẫu

Vì thu thập theo triệu chứng nên có thể những triệu chứng này là do ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, phân bón hay do điều kiện canh tác gây ra.

Ngoài ra, các mẫu thuốc lá và đậu phộng cùng được lấy tại huyện Bến Cầu đều không có biểu hiện nhiễm TSWV (0%), kết quả này cũng góp phần cho thấy rằng tại đây TSWV chưa xuất hiện và gây bệnh.

Trong khi đó, mẫu thuốc lá có biểu hiện dương tính với CMV (50%) và TMV (69,1%) khá cao. Như vậy, có thể nói rằng vào tháng 4 năm 2006 (thời gian thu thập mẫu), cây thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh đang chịu ảnh hưởng của CMV và TMV.

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá

Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)

Tân Biên 20 33 60,6 Bến Cầu 6 19 31,6 Chú thích: (+): Dương tính 0 10 20 30 40 50 60 70

Tân Biên Bến Cầu

Mẫu dương tính

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu

Kết quả từ Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.2 cho thấy: Trên tổng số mẫu thuốc lá thu được tại từng địa bàn điều tra, huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV khá cao (60,6%), trong khi đó tại huyện Bến Cầu tỷ lệ nhiễm CMV ít hơn (31,6%). Như vậy, Tân Biên có tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV cao gấp 2 lần so với Bến Cầu. Kết quả này có thể lý giải như sau:

Tỷ lệ %

20 30 40 50 60 70 80 90 100

Tân Biên Bến Cầu

Mẫu dương tính

CMV được lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá. Khi khảo sát tại huyện Tân Biên ta thấy cỏ dại, lùm bụi khá nhiều, không được phát quang. Đây chính là nơi cư trú tốt cho rệp, và tạo điều kiện cho chúng sinh sôi, phát triển mạnh mẽ. Vì thế, tại đây CMV được lan truyền nhanh hơn, nhiều hơn.

Tại Bến Cầu, công tác vệ sinh, dọn dẹp cỏ dại quanh khu vực trồng thuốc lá được thực hiện tốt hơn. Các bụi rậm được phát quang sạch sẽ, rệp không còn chổ để trú ẩn, không có điều kiện thuận lợi để phát triển. Nên số lượng không tăng thêm nhiều, khả năng truyền virus cũng giảm.

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá

Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)

Tân Biên 18 26 69,2

Bến Cầu 11 16 68,8

Chú thích: (+): Dương tính

Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu

Các số liệu từ Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.3 đã cho thấy: Tại huyện Tân Biên, thuốc lá nhiễm TMV khá cao (69,2%) và tại huyện Bến Cầu, tỷ lệ này cũng khá cao (68,8%). Khi so sánh tỷ lệ thuốc lá bệnh giữa 2 huyện, ta nhận thấy rằng tỷ lệ này là tương đương nhau.

Tỷ lệ %

TMV chủ yếu tồn tại trong tàn dư thực vật của vụ truớc để lại trên đồng ruộng. Nhưng hiện nay, tại các huyện này, sau khi thuốc lá được thu hoạch xong thì phần thân, rễ còn lại sẽ được giữ làm phân bón cho vụ sau mà không được đốt bỏ. Điều này đã tạo điều kiện cho TMV phát triển trở lại và tiếp tục gây bệnh cho vụ trồng kế tiếp.

TMV nằm trong xác cặn bã thực vật sẽ bị phân hủy ngoài tự nhiên trong vòng từ 5 đến 6 tháng do thời tiết. Tuy nhiên, vì Tây Ninh là một địa bàn chuyên canh trồng thuốc lá ở nước ta nên các vụ mùa được trồng liên tục, kế tiếp nhau, không có thời gian nghỉ giữa 2 vụ. Do đó, cây thuốc lá nhiễm bệnh từ vụ này sang vụ khác, năm này sang năm khác mà không thể khắc phục được.

Tỷ lệ nhiễm TMV khá cao tương đương nhau tại huyện Tân Biên và Bến Cầu cũng còn do sự lưu thông giữa những vùng trồng thuốc lá trong tỉnh. Những đoàn xe vận chuyển thuốc lá nguyên liệu trong quá trình di chuyển từ vùng này sang vùng kia, đồng thời cũng mang TMV trên những lá thuốc còn sót lại hay trên những vật dụng có liên quan theo và góp phần phát tán bệnh.

Ngoài ra, thuốc lá thường xuyên nhiễm CMV, TMV trong suốt mùa vụ và từ năm này sang năm khác còn vì lý do khách quan sau:

Tây Ninh là vùng trồng thuốc lá phổ biến với diện tích lớn, nhưng chủ yếu việc trồng trọt diễn ra ở những hộ gia đình, tập quán của người nông dân là thường trồng những loại cây như bầu bí, dưa, thơm hay vài loại hoa làm cảnh, đây chính là những cây ký chủ của CMV và TMV. Đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên các cây trồng này quanh năm. Nên khi các cây này đã nhiễm virus thì nó dễ dàng và nhanh chóng phát tán sang thuốc lá.

Khi trong vườn thuốc lá xuất hiện cây bị bệnh, nhưng vì lý do kinh tế, mà người nông dân thường vẫn tiếp tục trồng những cây này, mà không tỉa bỏ, vì thế từ một vài cây bệnh ban đầu đã mau chóng lan sang các cây khác.

4.1.5 Tỷ lệ thuốc lá chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập đƣợc

Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV

Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Tổng số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)

Chỉ nhiễm CMV 0 42 0 Chỉ nhiễm TMV 20 47,6 Nhiễm CMV và TMV 11 26,2 Chú thích: (+): Dương tính 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Chỉ nhiễm CMV Nhiễm CMV và TMV Chỉ nhiễm TMV Mẫu dương tính

Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV

Theo kết quả từ Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.4, số mẫu thuốc lá chỉ nhiễm TMV chiếm tỷ lệ cao nhất là 47,6%. Số mẫu nhiễm hỗn hợp CMV và TMV là 26,2%, nhưng không có mẫu nào nhiễm CMV mà không nhiễm TMV. Điều này cũng có nghĩa là tất cả các mẫu điều tra lúc này đều bị nhiễm TMV. Như vậy, có thể nói rằng TMV đang là virus gây bệnh chủ yếu cho thuốc lá ở Tân Biên và Bến Cầu vào thời điểm khảo sát.

Tỷ lệ %

0 10 20 30 40 50 60 70 80 TC1 TC2 TC3 Mẫu dương tính 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên cây thuốc lá

Sau khi so sánh kết quả chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và triệu chứng trên lá cây thuốc lá quan sát được trên đồng ruộng, tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh được thể hiện qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.5.

Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên lá

Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%) Lá dày, phồng rộp (TC1) 2 8 25 Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6 Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40 Chú thích: (+) : Dương tính TC1: Triệu chứng 1 [Hình 4.12 (D) và 4.13 (B)] TC2: Triệu chứng 2 [Hình 4.12 (C)] TC3: Triệu chứng 3 [Hình 4.13 (C) và 4.13 (D)]

Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng

Từ tỷ lệ này có thể cho phép nhận định: Các lá thuốc lá có triệu chứng khảm xanh – vàng (TC2) có khả năng nhiễm CMV và TMV (78,6%) khá cao.

Một số cây thuốc lá có biểu hiện triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc hơn so với các cây khác (tất cả được trồng cùng lúc và trong điều kiện canh tác như nhau) như trong Hình 4.13 (E). Nhưng trên lá của tất cả các cây có sự thay đổi hình thái vừa nêu trên đều mang một hay tất cả các triệu chứng đã xét trong Bảng 4.6. Vì vậy, có thể nói

Tỷ lệ

%

việc thu thập mẫu thuốc lá nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu hiện trên lá cây sẽ dễ dàng hơn là thu thập theo các triệu chứng khác.

Bên cạnh đó, cũng có một số cây thuốc lá có mang các triệu chứng như trên, nhưng lại không cho kết quả dương tính khi tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA. Điều này, một lần nữa cũng khẳng định rằng việc xác định cây nhiễm virus mà chỉ dựa vào triệu chứng biểu hiện là không hoàn toàn chính xác.

Trong quá trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tôi thấy có triệu chứng cong ngọn trên cây thuốc lá, là triệu chứng đặc trưng do TSWV gây ra. Tuy nhiên, những mẫu này, sau khi dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán đã không cho kết quả dương tính. Có lẽ, đó là do số lượng của TSWV quá ít, không đủ để biểu hiện thành phản ứng dương tính.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh của từng giống thuốc lá. Vì bà con nông dân ở đây đa số chỉ biết là mua giống tại công ty nào thôi, hầu như không quan tâm đến giống của cây thuốc lá đang trồng là gì.

Một lý do nữa, là do chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV và TSWV trên các cây thuốc lá được trồng trong nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc lá mang virus tới lây nhiễm cho cây) và các cây thuốc lá được trồng trong vườn của Tổng Công ty Thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu này chỉ được thực hiện trên những cánh đồng trồng thuốc lá của các hộ gia đình. Vì thế, chúng tôi chưa khảo sát được tỷ lệ nhiễm virus của thuốc lá khi trồng ngoài tự nhiên và khi trồng trong điều kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh.

(A) (B)

(C) (D)

Hình 4.12: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe

(A) (B)

(C) (D)

(E) (F)

(B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng cây nhiễm virus CMV và TMV

Hình 4.13: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên (2006) (A): Cây thuốc lá khỏe

4.2 Kết quả RT – PCR

Sau khi có kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA, chọn những mẫu dương tính mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR.

 Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ lá thuốc lá bằng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit do Bio – Rad cung cấp.

 Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với bộ kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio – Rad cung cấp.

Kết quả RT – PCR thu được có thành phần hóa chất và chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA

Thành phần hóa chất:

5X iScript Reaction Mix 4 μl iScript Reverse Transcriptase 1 μl

Nuclease free water 13 μl

RNA tổng số 2 μl Tổng thể tích 20 μl Chu trình nhiệt: 5 phút 25oC 40 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC

Bước 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR

Thể tích Nồng độ cuối

iTaq buffer 10X 5 μl 1 X

MgCl2 2,5 μl 2,5 mM

dNTP 1μl 200 µM

iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl

primer F 1 µl 0,4 μM

primer R 1 µl 0,4 μM

Nuclease free water 34 µl cDNA 5µl

Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 3 phút ở 94o C 35 chu kỳ 1 phút ở 94o C 1 phút ở 57oC 1 phút 15 giây ở 72o C 1 chu kỳ 7 phút ở 72oC Giữ ở 4oC trong 10 phút.  Đổ gel điện di sản phẩm PCR

Gel agarose có nồng độ 1,5%, tiến hành điện di với hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong vòng 60 phút.

Ngâm trong EtBr trong vòng 20 phút.

 Kết quả điện di

Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên

La : Thang chuẩn 1000 bp

1, 2, 3 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 22, 26, 42

Sản phẩm PCR trên Hình 4.14 có kích thước khoảng 1000 bp.

Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu

La : Thang chuẩn 1000 bp

4, 5, 6 : Sản phẩm PCR 3 mẫu 53, 54, 62

Sản phẩm PCR trên Hình 4.15 có kích thước khoảng 1000 bp.

Kết quả điện di trên Hình 4.14 và Hình 4.15 đã cho thấy các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp thay vì là 921 bp. Tuy kết quả này không đúng với lý thuyết nhưng các sản phẩm này có kích thước khá gần với kích thước lý thuyết.

Các mẫu 22, 26, 42 (thu thập tại huyện Tân Biên) và các mẫu 53, 54, 62 (thu thập tại huyện Bến Cầu) là những mẫu cho kết quả dương tính với TMV rõ nhất trong chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA. Các mẫu này sau khi tiến hành RT – PCR thì các sản phẩm PCR thu được đều có kích thước khoảng 1000 bp.

Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh đã tiến hành chẩn đoán TMV trên cây cà chua của tỉnh Lâm Đồng cũng bằng phương pháp RT – PCR., với cùng cặp mồi đang sử dụng. Kết quả sản phẩm PCR thu được cũng có kích thước khoảng 1000 bp.

Điều này có thể chứng minh được rằng:

Có sự hiện diện của TMV trong các mẫu thuốc lá thu thập được.

Thuốc lá tại 2 huyện Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh nhiễm cùng môt dòng TMV.

Như vậy, bước đầu có thể kết luận, tại Việt Nam, cà chua và thuốc lá đã nhiễm cùng một dòng TMV.

Tuy nhiên, dòng virus này lại có khác biệt với dòng virus được dùng để thiết kế