2.8.1. Các chất chống oxy hố giúp tăng cƣờng bảo quản (Antioxydant)
Các chất chống oxy hĩa phải đảm bảo các điều kiện sau: * Khơng độc.
* Cĩ hoạt tính cao ở nồng độ thấp (0,01 – 0,02 %).
* Nằm ở bề mặt phân cách, cĩ tính kỵ nƣớc khá mạnh, tiếp xúc với khơng khí. * Ổn định với các điều kiện chế biến.
Pha độ ng Hệ thố ng chuyể n dung mơi Hệ thố ng bơ m mẫ u Cộ t Detector Chuẩ n bị mẫ u Hệxử thố lý dững liệ u
Một số antioxydant quan trọng : BHT, BHA, tocopherol, axit ascorbic… Trong đĩ BHT, BHA là những chất chống oxy hố đƣợc sử dụng phổ biến nhất.
BHT (butylated hydroxytoluen) cĩ cơng thức phân tử 2,6 – di – tert – butyl – 4 – methylphenol), là tinh thể màu trắng với mùi khĩ ngửi, khơng hồ tan trong nƣớc và propylene glycol nhƣng hịa tan tốt trong cồn. BHT đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân chống oxy hĩa, do đĩ nĩ đƣợc dùng trong cơng tác bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, nguyên liệu đĩng gĩi, nĩi chung là những sản phẩm cĩ chứa mỡ hoặc dầu. Ngồi BHT, BHA (butylated hydroxyanisole) cũng cĩ chức năng nhƣ BHT. BHT và BHA đƣợc biết là an tồn cho ngƣời và động vật sử dụng.
2.8.2. Các chất hấp phụ
Những chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng là bột talc, cám gạo, silicagel, than hoạt tính…
2.8.2.1. Talc
Talc là 1 loại khống sản, cĩ tên là hydrated magnesium sheet silicate với cơng thức hố học Mg3Si4O10(OH)2. Một tấm talc gồm hàng ngàn phiến cơ bản chồng lên nhau, phiến cơ bản là sự kết hợp của 1 lớp magnesium-oxygen/hydroxyl octahedra kẹp giữa 2 lớp siliconoxygen tetrahedra, mặt ngồi chính của phiến cơ bản này khơng chứa nhĩm hydroxyl hoặc iơn hoạt động, điều này giải thích cho tính kỵ nƣớc và tính trơ của talc. Cĩ nhiều loại talc, tất cả chúng đều mềm, dẹt, kỵ nƣớc, trơ về mặt hĩa học. Trên thực tế talc khơng hịa tan trong nƣớc, tan yếu trong axit và kiềm, khơng gây nổ hay gây cháy. Mặc dù rất ít hoạt động về mặt hố học nhƣng talc lại cĩ một ái lực lớn với các chất hữu cơ.
Talc là một phần quan trọng trong cuộc sống hằng ngày, đá lát đƣờng đi, tạp chí chúng ta đọc, sợi polyme, sơn… là một trong những sản phẩm làm từ talc.
* Trong nơng nghiệp và thực phẩm, talc là tác nhân chống đĩng bánh hiệu quả, chống dính trong thực phẩm (kẹo gum), giúp đánh bĩng gạo, trong quá trình sản xuất dầu oliu, làm tăng sản lƣợng và sự trong của dầu.
* Trong cơng nghệ sản xuất giấy, làm láng bề mặt giấy.
* Sản phẩm chăm sĩc cơ thể, do tính mềm và trơ, talc đƣợc dùng nhƣ phấn xoa cơ thể, ngày nay nĩ đĩng vai trị quan trọng trong sản xuất mỹ phẩm, phấn hồng, phấn mắt, xà bơng…
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
Chế tạo và thử nghiệm chế phẩm dạng viên nén để phịng trị ngài gạo với hoạt chất chính trích từ hạt neem trồng tại Việt Nam, bao gồm các giai đoạn nghiên cứu nhƣ sau:
* Hồn thiện kỹ thuật ép dầu hạt neem và chiết xuất hoạt chất trong bánh dầu neem bằng ethanol.
* Định lƣợng ba hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu: azadirachtin, salannin, nimbin.
* Tạo chế phẩm dạng viên nén và thử nghiệm chế phẩm trên ngài gạo trong điều kiện phịng thí nghiệm.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem
Hạt neem thu tại tỉnh Ninh Thuận đƣợc rửa cồn 98o sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 45 – 50oC. Sau đĩ sử dụng máy tách vỏ để thu nhân hạt. Nhân hạt neem đƣợc ép dầu bằng máy ép chuyên dụng hiệu Komet của Đức (cơng suất 10 kg hạt/ giờ).
Ƣu điểm của máy là giữ nhiệt độ trong quá trình ép chỉ từ 35 – 40oC. Dầu neem sau khi ép đƣợc giữ ở nhiệt độ 5 – 10oC tránh ánh sáng, thêm chất bảo quản BHT 3 % và tween 5 % tạo thành chế phẩm dầu neem thơ, kí hiệu là DN (dầu neem).
Bánh dầu neem (phần bã cịn lại sau khi ép dầu) đƣợc ngâm với ethanol 98o
để tách các hoạt chất cịn lại theo tỉ lệ 1: 4 (bánh dầu : ethanol). Sau 24 giờ, dịch chiết thơ đƣợc loại dung mơi bằng máy cơ quay chân khơng ở nhiệt độ 60oC. Thu nhận dịch chiết và bảo quản nhƣ dầu neem, gọi là chế phẩm dịch chiết bánh dầu, kí hiệu - DCBD
Hình 3.1. Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hạ t neem Tách vỏ V ỏ Nhân hạ t neem Ép dầ u Bánh dầ u Ngâm bánh dầ u Bã neem Cồ n 98o Dị ch chiế t neem thơ Cơ quay chân khơng Cồ n thu hồ i Dị ch chiế t neem (DCBD) Dầ u neem (DN) Cồ n 980 Sấ y 45-500 C Khuấ y, lắ ng, lọ c Chấ t bả o quả n, nhũ hố Chấ t bả o quả n, nhũ hố
3.2.2. Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu neem
Theo schneider và Elmer (1987) việc định lƣơng azadirachtin, nimbin và salannin đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Mẫu sau khi qua lọc (lỗ lọc = 0,45 µm) đƣợc cho vào ống đựng mẫu cĩ thể tích 1,5 ml, sau đĩ đựng vào khay đựng mẫu trong máy HPLC (hiệu Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography)và
Tiến hành chạy mẫu với các thơng số sau: - Lƣợng mẫu bơm vào cột: 0,5 µl.
- Cột bảo vệ: BondapakTMC18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 20 mm. - Cột phân tích: BondapakTMC18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 300 mm. - Dung mơi rửa cột: CH3CN:H2O (55 – 45); tốc độ dịng: 0,5 ml/ phút. - Detector DAD, Bƣớc sĩng 220 nm.
Để xây dựng đƣờng chuẩn của hoạt chất chính cần phân tích, sử dụng azadirachtin chuẩn của cơng ty Sigma (USA), nimbin và salannin chuẩn của cơng ty Trifolio GmbH (Germany).
Kết quả đƣờng chuẩn nhƣ sau:
- Azadirachtin: y = 3,72 x + 34,58; Hệ số tƣơng quan R = 1. - Nimbin: y = 14,49 x + 170,5; Hệ số tƣơng quan R = 0,998. - Salannin: y = 12,634 x + 73,83; Hệ số tƣơng quan R = 1. Trong đĩ: y - diện tích pick, x - nồng độ hoạt chất (ppm).
Định lƣợng hoạt chất trong mẫu thử đƣợc tính tự động nhờ phần mềm chemstation hãng Aligent-technology cho kết quả nồng độ hoạt chất (ppm) cĩ trong mẫu thử.
a b
c d
Hình 3.2. Một số máy mĩc, trang thiết bị
a. Máy tách vỏ
b. Máy cơ quay chân khơng
c. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao d. Máy ép dầu hạt neem (komet - Đức)
3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết bánh dầu. bánh dầu.
Chế phẩm đƣợc tạo thành trên cơ sở phối trộn dầu neem và dịch chiết bánh dầu với chất hấp phụ thích hợp, cĩ bổ sung chất chống oxy hố. Sau đĩ đùng khuơn để tạo hình chế phẩm. Tiến hành khảo sát từng bƣớc để chọn lựa loại nguyên vật liệu và nồng độ thích hợp của chúng trong chế phẩm.
Chất hấp phụ: sử dụng bột talc, cám gạo, silicagel, và than hoạt tính. Từng chất hấp phụ đƣợc trộn riêng với dầu neem và dịch chiết bánh dầu (nồng độ 5 %). Sau khi ép tạo hình, các chế phẩm thơ này đƣợc dùng để xử lý ngài gạo (đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.6.3. phần tổng quan tài liệu). Dựa vào kết quả ấu trùng chết sau 48 giờ, khả
năng pha trộn và tạo hình để tạo ra chất hấp phụ thích hợp.
Chất hỗ trợ thăng hoa: sử dụng tinh dầu thơng, tinh dầu tràm và tinh dầu bạc hà – là những thƣơng phẩm dễ dàng mua ở thị trƣờng. Tinh dầu đƣợc chọn chủ yếu dựa vào kết quả khảo sát sự hao hụt của chúng trong 24 giờ với cùng thể tích ban đầu (10 ml), cùng điều kiện thí nghiệm ( cốc thủy tinh 50 ml, nhiệt độ phịng) và khả năng dẫn dụ ngài gạo lên trên bề mặt.
Thí nghiệm xác định nồng độ tinh dầu thích hợp đƣợc tiến hành trong phạm vi từ 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 – 4,0 (%) cũng dựa vào khẳ năng dẫn dụ của chúng đối với ngài gạo.
Chất bảo quản: Sử dụng chất BHT (butylhydroxi toluene) ở nồng độ 3 %.
Hoạt chất chính: dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng độ 5 – 10 – 15 – 20 % trên cùng nền chất hấp phụ, tinh dầu, chất bảo quản đã xác định trƣớc đĩ, tạo thành bốn cơng thức chế phẩm.
Hình 3.3. Quá trình tạo chế phẩm viên nén
3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm
ăn chính là cám gạo, ở điều kiện nhiệt độ phịng, ẩm độ 75 – 85 %. Sau khi vũ hố, những con thành trùng (bƣớm) đực và cái đƣợc cho nhốt riêng trong lồng cĩ lƣới đậy để đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và quét trứng thu đƣợc lên một thau cám khác để tạo điều kiện chu trứng nở. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành bổ sung cám thƣờng xuyên để ấu trùng cĩ đủ dinh dƣỡng, tăng khả năng vào nhộng.
Hình 3.4. Nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm
3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối với ngài gạo. với ngài gạo.
3.2.5.1. Vật liệu
- Ấu trùng ngài gạo ( tuổi 3) nhân nuơi ở phịng thí nghiệm, trong mơi trƣờng cám gạo.
- Lọ nhựa loại 1 lít và gạo sạch. - Ống bắt cặp và thu trứng.
- Giấy đẻ trứng, chổi cọ, kẹp gắp, lọ ủ trứng. - Chế phẩm neem viên nén.
3.2.5.2. Phƣơng pháp tiến hành
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong các lọ nhựa thể tích 1 lít chứa 400 g gạo sạch và 20 ấu trùng ngài gạo. Sau khi đặt chế phẩm lên trên bề mặt gạo, đậy kín lọ để thuốc tác dụng. Sau 3 ngày, mở nắp lọ và đếm số ấu trùng chết. Thí nghiệm đƣợc theo dõi
mỗi ngày để thu nhận số ấu trùng chết thêm và đánh giá sự sinh trƣởng của nhĩm đối tƣợng bị xử lý. Số ấu trùng ngài gạo sống sĩt sau đợt xử lý sẽ đƣợc tiếp tục nuơi dƣỡng trong điều kiện bình thƣờng để theo dõi các tác động lâu dài và đa dạng của chế phẩm neem đối với chúng.
3.2.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả
Đếm tổng số ấu trùng chết sau 3 ngày và 7 ngày xử lý các chế phẩm, từ đĩ tính ra tỉ lệ chết của từng nghiệm thức, làm cơ sở để tính LD50 của các chế phẩm.
Số ấu trùng cịn sống sĩt sau đợt xử lý sẽ đƣợc theo dõi mỗi ngày để ghi nhận một số chỉ tiêu sinh học nhƣ sau:
* Tỷ lệ thành trùng tạo thành và tỷ lệ thành trùng biến dạng.
* Số lƣợng trứng và tỷ lệ trứng nở của các thành trùng cĩ bề ngồi bình thƣờng và dị dạng theo cách tiến hành nhƣ sau:
- Các thành trùng đực và cái cĩ hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức sẽ đƣợc phối cặp trong các ống nghiệm cĩ đặt sẵn băng giấy để thu trứng. Tổng số trứng sau khi đếm sẽ đƣợc ủ trong lọ thủy tinh ( loại 15 ml) cĩ chứa gạo để theo dõi số lƣợng ấu trùng nở.
- Thành trùng cái biến dạng và thành trùng đực cĩ hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức cũng sẽ đƣợc phối cặp với nhau và cũng thực hiện các bƣớc giống nhƣ trên.
3.2.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm cĩ 20 nghiệm thức (4 loại chế phẩm × 5 nồng độ xử lý) đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức cĩ chứa 20 ngài gạo tuổi 3.
Bốn chế phẩm là NV1, NV2, NV3, NV4.
Năm nồng độ xử lý là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 g/ dm3.
3.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu của các nghiệm thức đƣợc phân tích biến lƣợng ANOVA (Analysis of variance) và phân hạng theo trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm statgraphic 7.0. Độ độc của chế phẩm (LC50, LD50) đƣợc tính theo phƣơng pháp phân tích probit.
a b
c d
e
Hình 3.5. Quá trình tiến hành thí nghiệm
a,b. Bố trí thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Đếm sâu chết sau thí nghiệm d. Bắt cặp ngài gạo
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Hiệu suất thu nhận dầu neem bằng phƣơng pháp ép nguội
Kết quả sử dụng máy Komet (Đức) để ép nguội nhân hạt neem (ẩm độ 14,8 %) với tốc độ 10 kg nhân/ giờ, chúng tơi thu đƣợc dầu neem màu vàng nâu với hiệu suất 30 %. Ƣu điểm của máy này là khống chế đƣợc nhiệt độ 35 - 40oC trong quá trình ép, vì vậy khơng ảnh hƣởng đến tính ổn định của các thành phần hoạt chất cĩ trong dầu. Ngồi ra, khi ép cịn trích ra đƣợc nhiều limonoid và hợp chất sulfur cĩ trong nhân hạt, gĩp phần làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và cơn trùng của dầu neem. Nhìn chung, phƣơng pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém, năng suất tƣơng đối cao và cĩ khả năng đáp ứng yêu cầu của sản xuất lớn.
4.2 Kết quả định lƣợng một số hoạt chất chính trong các chế phẩm neem thơ Bảng 4.1. Hàm lƣợng (ppm) của một số hoạt chất trong dầu neem và dịch chiết bánh dầu
Hoạt chất Chế phẩm neem thơ
Dầu neem Dịch chiết bánh dầu Azadirachtin Nimbin Salannin 930,69 262,58 1027,48 7703,61 841,09 3214,56 Tổng số 2220,75 11759,26
Theo Seeni và ctv (1993), hàm lƣợng hoạt chất trong cây neem phụ thuộc chủ yếu vào giống và điều kiện sinh trƣởng của cây. Ngồi ra, những yếu tố khác nhƣ tuổi cây, điều kiện địa lý nơi trồng ( trong đĩ quan trọng nhất là điều kiện nhiệt độ, độ ẩm,
ánh sáng), thời điểm thu hoạch quả, kỹ thuật sơ chế, bảo quản nguyên liệu và kỹ thuật chiết xuất, ly trích cũng đĩng vai trị quan trọng đối với hoạt chất.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng azadirachtin trong dầu neem Việt Nam thu đƣợc từ phƣơng pháp ép nguội là 930,69 ppm, cao hơn nhiều so với phƣơng pháp chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ. Theo Vũ Đăng Khánh (2003), dầu neem Ấn Độ và Việt Nam đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất bột nhân hạt neem trong hexan cĩ hàm lƣợng azadirachtin thấp, tƣơng ứng là 90 ppm và 100 ppm. Tuy nhiên, do là chất phân cực mạnh nên azadirachtin chỉ tan tốt trong dung mơi phân cực nhƣ ethanol, vì vậy trong dịch chiết bánh dầu, kết quả hàm lƣợng azadirachtin lên đến 7703,61 ppm. Hàm lƣợng nimbin và salannin trong dịch chiết bánh dầu cũng cao hơn trong dầu neem, tƣơng ứng là 841,09 và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu; 262,58 và 1027,48 ppm trong dầu neem. Tổng cộng 3 thành phần hoạt chất chính thì dịch chiết bánh dầu chứa 11759,26 ppm, dầu neem chứa 2220,75 ppm.
4.3.Tạo chế phẩm viên nén 4.3.1. Chất hấp phụ
Mục tiêu là tìm kiếm các nguyên liệu ít độc, khơng phản ứng hĩa học với chất bị hấp phụ và phức chất tạo thành sẽ giải phĩng từ từ các chất bị hấp phụ mà khơng làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngồi ra cịn ƣu tiên chọn loại vật liệu cĩ giá rẻ và dễ ép thành viên.
Dựa vào kết quả thí nghiệm sàng lọc trên nhiều loại vật liệu tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới (Lê Thị Thanh Phƣợng, 2005), chúng tơi chỉ tập trung khảo sát hai loại nguyên liệu là bột talc và cám gạo. Các nguyên liệu trên đƣợc trộn với dầu neem và dịch chiết bánh dầu riêng rẽ hoặc phối hợp ở nồng độ 10 %, bổ sung tinh dầu thơng 1 % để hỗ trợ thăng hoa. Sau khi phối trộn, xử lí ngài gạo ở liều 2 g/ dm3. Kết quả trình bày ở bảng 4.2.
Nhìn chung, sự kết hợp giữa dầu neem (DN) và dịch chiết bánh dầu (DCBD) trên 3 loại nguyên liệu đều mang lại hiệu quả gây chết ngài gạo cao hơn so với từng chế phẩm riêng lẽ. Trên nền bột talc, hỗn hợp DN – DCBD cho tỉ lệ chết ấu trùng cao nhất là 81,2 %, nhiều hơn 32,3 % so với DN 10 % và nhiều hơn 12,7 % so với DCBD 10 %. Trên nền cám gạo, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 63,5 %,
nhiều hơn 39 % so với DN và nhiều hơn 22,8 % so với DCBD. Tƣơng tự, trên nền talc – cám, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 71,6 %, nhiều hơn 33,1 % so với DN và 19,7 % so với DCBD.
Bảng 4.2. Tỉ lệ (%) ấu trùng chết sau 3 ngày
Nguyên liệu Chế phẩm neem thơ (10 %)
DN DCBD DN - DCBD