Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ loài. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn của vi khuẩn bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 [9]. Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9).
1200 base
500 base
Chú thích: 1: LM2, 2: TS7, 3: TN10, 4: TD15, M: Ladder (Thang DNA chuẩn). Hình 4.9: Sản phẩm điện di trên gel với cặp mồi FPGS6 với 2R và
FPGS1509 với 2F.
4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tƣơng đồng của các chủng với các loài
Methylobacterium đã công bố.
Kết quả giải trình tự được xác định độ chính xác bằng phần mềm fastPCR. Kết quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành lấy hai trình tự đúng để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của BCBI. Kết quả so sánh trình tự với dữ lệu trên ngân hàng gene của NCBI (Mỹ).
Bảng 4.6: Hệ số tương đòng Sj của chủng TN10 so với các chủng công bố
Tên loài Độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj)
M. aminovorans 96 0,400 M. chloromethanicum 96 0,222 M. dichlorometanicum 96 0,273 M. extorquens 96 0,167 M. jeotgali 96 N M. organophilum 96 0,455 M. podarium 96 N
M. rhodesianum 96 0,273 M. rhodinum 96 0,636 M. soumiense 96 0,273 M. thiocyanatum 96 0,500 M. zatmanii 96 0,333 1019 0,769
chú thích: Hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%), N: không xác định. Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các chủng đã công bố.
Tên loài Mức độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj)
M. aminovorans 99 0,600 M. chloromethanicum 99 0,889 M. dichlorometanicum 99 0,778 M. extorquens 99 0,750 M. fujisawaense 99 0,333 M. jeotgali 99 N M. lusitanum 99 0,727 M. organophilum 88 0,455 M. podarium 99 N M. populi 99 0,667 M. radiotolerans 88 0,500 M. rhodesianum 99 0,727 M. rhodinum 99 0,545 M. zatmanii 99 0,667 1019 0,462
Mối quan hệ của trình tự hai chủng so với các chủng trên ngân hàng gen NCBI và của phòng thí nghiệm được biểu diển trên cây sinh loài được vẽ bằng phần mềm CluxtalX và Treeview.
Hình 4.10: Cây sinh loài của các chủng trong chi Methylobacterium.
Từ những số liệu so sánh này có thể thấy rằng mức độ tương đồng trình tự giữa chủng thí nghiệm với chủng đã công bố tương đối lớn. Nên chúng tôi có thể kết luận chính xác hơn là hai chủng đã giải trình tự đúng thuộc chi Methylobacterium. Chủng LM2 có quan hệ gần với chủng 1019 và TN10 cả ba chủng này cùng xếp trong cùng một nhánh lớn với M. thiocyanatum. Kết hợp với độ tương đồng sinh hóa thì chủng LM2 và chủng 1019 (0,462), chủng TN10 với chủng 1019 (0,769) là tương đối nhỏ. Nên chúng tôi cho rằng hai chủng LM2 và TN10 khác biệt lớn với chủng 1019 và các loài Methylobacterium sp. đã công bố nên chúng tôi cho rằng có thể hai chủng LM2 và TN10 là hai chủng mới Tuy nhiên, những kết luận này chưa chính xác 100% bởi vì trình tự 500 base chỉ có thể định danh vi khuẩn Methylobacterium tới mức độ chi và các đặc điểm sinh hóa cũng không thể định danh chính xác đến mức độ loài.
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp 4.4.1. Kết quả định tính auxin
Kết quả định tính auxin bằng thuốc thử Salkowski cải tiến. Trong bốn chủng thí nghiệm chỉ có hai chủng TS7 và TN10 có phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowski cải tiến. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), Ivanova và ctv (2001), một số chủng thuộc chi Methylobacterium có thể tổng hợp auxin. Từ đó có thể khẳng định rằng hai chủng này có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ đủ phát hiện, còn hai chủng LM2 và TD15 có thể chúng không thể tổng hợp auxin hoặc nồng độ auxin tạo ra của hai chủng này không đủ lớn để có thể phản ứng với thuốc thử Salkowski cải tiến.
Chú thích:
DC1: Đối chứng âm chủng E.coli DC2: Đối chứng dương IAA chuẩn
4.4.2. Kết quả định tính PHB.
Trong bốn chủng đã thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với thuốc thử Nile Blue A. Trong khi đó, theo Trâm (2006) [8], thì các chủng thuộc chi
Methylobacterium có khả năng tổng hợp PHB. Từ kết quả này chúng tôi có thể kết luận rằng, tất cả các chủng đã thử nghiệm có khả năng tổng hợp PHB. Với các hạt sáng khác nhau chúng tôi cũng có thể khẳng định rằng các chủng có thể tổng hợp PHB ở nồng độ khác nhau.
Chú thích: DC: Mẫu đối chứng chủng E.coli.
Phần V: Kết luận và đề nghị
Sau thời gian nghiên cứu mặc dù có nhiều cố gắng. Tuy nhiên, do thời gian tiến hành có giới hạn nên chúng tôi chỉ đạt được một số kết quả nhất định và những kết quả này chỉ là kết quả bước đầu. Các kết quả đạt được:
- Phân lập và làm thuần và khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa tổng số 26 khuẩn lạc, trong đó chia thành bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý,sinh hoá. - Đã định danh được các chủng thuộc chi Methylobacterium bằng các phương
pháp Sinh học Phân tử. Trong đó, có hai chủng TS7 và TD15 chỉ định danh được ở mức độ có đoạn DNA đặc trưng và hai chủng LM2 và TN10 định danh được tới mức độ so sánh trình tự đoạn DNA 500base trong vùng 16S rDNA. - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn.
Trong đó, bốn chủng đều có khả năng tổng hợp PHB và có hai chủng LM2 và TN10 có khả năng tổng hợp auxin là TS7 và TN10.
Từ những kết quả đó chúng tôi có những đề nghị sau:
Cần tiến hành giải trình tự lại đoạn 1200 base của hai chủng trên cũng như các chủng đã giải sai để có thể định danh chính xác hơn đến mức độ loài.
Định lượng lượng PHB tạo ra là bao nhiêu để có thể ứng dụng trong thực tế. Kiểm tra khả năng tổng hợp auxin, cytokinins, khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt, khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật ở điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro của các loài thuộc chi Methylobacterium trên để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, sử dụng làm nguyên liệu trong nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác.
Phần V: Tài liệu tham khảo
Tài liệu tiếng việt
[1] Bùi Huy Đáp. Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp, 1999.
[2] Trƣơng Đức. Kỹ thuật trồng các giống lúa mới, NXB Nông Nghiệp, 2000
[3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật học, NXB giáo dục 1998
[4] Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm. Sổ tay kiểm
nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB nông nghiệp Hà Nội 2005. [5] Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu. Sinh học phân tử giới thiệu phương
pháp và ứng dụng. NXB Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 2005. [6] Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phƣợng Trang,
Phạm Thị Hồng Tƣơi. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia
thành phố Hồ Chí Minh, 2001.
[7] Lê Duy Linh, Trần Thị Hƣờng, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng.
Thực tập vi sinh cơ sở. NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 2001.
[8] Lê Thị Thuỳ Trâm. 2006. Nghiên cứu thu nhận nhựa phân huỹ sinh học
poly- -hydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp. phân lập tại Việt Nam luận văn thạc sĩ sinh hóa, Đại Học Khoa Hoc Tự Nhiên.
Tài liệu tiếng nước ngoài.
[9] Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus B. (2001). “Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes”, Journal of Bacteriology, Vol. 183, No. 1, pp. 214–220.
[10] Ackermann J.-U., Müller S., Lösche A., Bley T., Babel W. (1995).
“Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content under growth limitations and accumulate PHB”, Journal of Biotechnology, Vol. 39, pp. 9-20.
[11] Anesti V., McDonald I. R., Ramaswamy M., Wade W. G., Kelly D. P., Wood A. P. (2005). “Isolation and molecular detction of Methylotrophic
bacteria occurring in the human mouth”, Enviromental Microbiology, Vil. 7, No. 8, pp. 1227-1238.
[12] Anesti V., Vohra J., Goonetilleka S., McDonald I. R., Str bler B., Stackebrandt E., Kelly D. P., Wood Ann P. (2004). “Molecular
detection and isolation of facutatively methylotrophic bacteria, including
Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot microflora”,
Environmental Microbiology, Vol. 6, Iss. 8, pp. 820-830.
[13] Arauujo W. L., Maccheroni W. Jr., Aguilar-Vildoso C. I., Barroso P. A. V., Saridakis H. O., Azevedo J. L. (2001). “Variability and
interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks”, Cannada Journal Microbiol, Vol. 47, pp. 220-236.
[14] Arauujo W. L., Marcon J., Maccheroni W. Jr., Van Elsas J. D., Van Vuurde J. W. L., Azevedo J. L. (2002), “Diversity of endophytic
bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 68, No. 10, pp. 4906-4914.
[15] Arthi K., Appalaraju B., Parvathi S. (2003). “Vancomycin sensitivity
and KOH string test as an alternative to gram staining of bacteria”, India Journal of Medical Microbiology, Vol. 21, pp. 121-123.
[16] Axel Ehmann (1977). “The van urk-salkowski reagent - a sensitive and
specific chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic detection and identification of indole derivatives”, Journal of Chromatography, Vol. 132, pp. 267-276.
[17] Aziz. N.H, El-Fouly. M.Z, El-Essawy. A.A, and Khalaf. M.A. Influence
of bean seadling root exudates on the rhizophere colonization by
Trichoderma lignorum for the control of Rhizoctonia solani. Bot. Bull. Acad. Sin. 1997, 38: 33 – 39.
[18] Benchimol R., Chu E., Yuimuto R., Dias-Filho M. B. (2000).
“Fusariosis control in black perper plants with bacterial endophytes survival and morphophylogical responses”, Pesq. Agropec. Bras., Brasília, Vol. 35, No. 7, pp. 1343-1348.
[19] Bloemberg, G. V., and Lugtenberg, B. J. J. 2001. Molecular basis of
plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Plant Biol. 4:343-350.
[20] Chistoserdova L., Chen S.-W., Lapidus A., Lidstrom M. E., (2003).
“Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1from a genomic point of view”, Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 10, pp. 2980-2987. [21] Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M. G., Marx C. J., Lapidus A., Vorholt J. A., Staley J. T., Lidstrom M. E. (2004). “The
enigmatic planctomycetes may hold a key to the origins of Methanogenesis and Methylotrophy”, Molecular Biology ang Evolution, Vol. 21, No. 7, pp. 1234-1241.
[22] De Marco P., Pacheco C. C., Figueiredo A. R., Moradas-Ferreira P. (2004). “Novel pollutant-resistant methylotrophic bacteria for use in
bioremediation”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 234, pp. 75-80.
[23] Department of health and ageing office of the gene technology regulator. 2005. The biology and ecology of rice (Oryza sativa L.) in Australia.
[24] Doronina N. V., Ivanova E. G., and Trotsenko Yu. A. (2002a). “New
evidence for the ability of Methylobacteria and Methanotrophs to synthesize auxin”, Microbiology, Vol. 71, No. 1, pp. 116–118. Translated from Mikrobiologiya, Vol. 71, No. 1, pp. 130–132.
[25] Doronina N. V., Trotsenko Y. A., Kuzentsov B. B., Tourova T. P., Salkinoja-Salonen M. S. (2002b). “Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 52, pp. 773-776.
[26] Farah Ahmad, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan. Indole Acetic Acid
Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonasin the Presence and Absence of TryptophanFarah. Department of Agricultural Microbiology, Faculty of Agricultural Sciences, Aligarh Muslim University, 2002.
[27] Figueira M. M., Larameùe L., Murrell J. C., Groleau D., Miguez C. B. (2000). “Production of green fluorescent protein by the methylotrophic
bacterium Methylobacterium extorquens”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 193, pp. 195-200.
[28] Fournier D., Trott S., Hawari J. and Spain J. Metabolism of the
Aliphatic Nitramine 4-Nitro-2,4-Diazabutanal by Methylobacterium sp. Strain JS179. Applied And Environmental Microbiology, Aug 2005, p. 4199 – 4202.
[29] Gallego V., García M.T., Ventosa A. (2005c). “Methylobacterium isbiliense sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla, Spain”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 55, pp. 2333-2337.
[30] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005a). “Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp. 281-287.
[31] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005b). “Methylobacterium variabile sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an aquatic environment”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 55, pp. 281-287.
[32] Garcia de Salamone I. E., Hynes R. K., Nelson L. M. (2001).
“Cytokinin production by plant growth promoting rhizobacteria and selected mutants” Canada Journal Microbiology, Vol 47, pp. 404-411. [33] Glick, B. R. 1995. The enhancement of plant growth by free-living
bacteria. Can. J. Microbiol. 41:109-117.
[34] Green P. N. (1992). “The Genus Methylobacterium”, pp. 2342-2345. In Balows A., Trüper H. G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K. H. (ed.)
The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin.
[35] Gromovykh. T, Tulpanova V, Shmarlovskaya. S, Gromovykh. V, Makhova H. Strains of Trichoderma Benefit for Biological Control Seedlings Pathogens.
[36] Hanson R. S., Hanson T. E. (1996). “Methanotrophic Bacteria”,
Microbiological reviews, Vol. 60, No.2: pp: 439-471.
[37] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K. A., Fukuyama M. and Tabuchi K. (1995). “Phenotypic and genetic diversity of chrorine-
resistant Methylobacterium strains isolated from various enviroment”,
Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol. 61, No. 6, pp. 2099- 2107.
[38] Hirano. S.S., and C. D. Upper. 2000. Bacteria in the leaf cosystem with
emphasis on Pseudomonas syringae: a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:624–653.
[39] Holland M. A. (1997) “Are cylokinin produced by plant?”, Plant Physiology, Vol. 115, pp. 865-868.
[40] Holland M. A., Polacco J. C. (1994). “PPFMs and other covert
contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol. 45, pp. 197-209.
[41] Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A., Staley J. T., Williams S. T. (1994). Bergey’s manual of Determinative bacteriology, Ninth Edition, The Williams and Willins Company, pp. 88-145.
[42] Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U. (2002). “Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica:
effects of Methylobacterium strains on protonema development”,Plant biol (Stuttg) Vol. 4, pp. 682-687.
[43] Idris R., Trifonova R., Puschenreiter M., Wenzel W. W., Sessitsch A. (2004). “Bacterial communities associated with flowering plants of Ni
hyperaccumulator Thlaspi goesingense”, Applied and Enviromental Microbiology , Vol. 70, No. 5, pp. 2667-2677.
[44] Ilan Chet, Ada Viterbo, Yariv Brotman, Tamir Lousky. Enhancement
of plant disease resistance by the biocontrol agent Trichoderma.
[45] Jaftha J. B., Strijdom B. W., Steyn P. L. (2002). “Characterization of
pigmented methylotrophic bacteria which nodulate Lotonosis bainesii”,
[46] Jeon J.-S., Lee S.-S., Kim H.-Y., Ahn T.-S., Song H.-G. (2003). “Plant
growth promotion in soil by some inoculated microorganisms”, The Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 4, pp. 271-276.
[47] Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I. (2003). “Stimulation of wheat
morphogenesis in vitro by Methanotrophic bacteria” Doklady Biological Sciences, Vol. 388, pp. 76–78, Translated from Doklady Akademii Nauk, Vol. 388, No. 6, pp. 847–849.
[48] Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E. B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya. I. (2000). “Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by
associative methylotrophic bacteria”, Russian Journal of Plant Physiology, Vol. 48, No. 4, pp. 514-517. Translated from Fiziologiya Rastenii, Vol. 48, No. 4, pp. 596-599.
[49] Katircioglu H.,Aslim B.,Yüksekdao Z. N., Mercan N., Beyatli Y. (2003). “Production of poly-b-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation
of putative Bacillus mutant strains by SDS-PAGE of total cell protein”,
African Journal of Biotechnology, Vol. 2, No. 6, pp. 147-149.
[50] Kloepper. J. W., and Schroth. M.N. (1978). Plant growth-promoting
rhizobacteria on radishes. Pages 879-882. Plant Pathogenic Bacter. Vol. 2, Station de Pathologie Vegetale et Phytobacteriologie, INRA, Angers, France.
[51] Koenig R. L., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source
of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp”, Journal of bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842.
[52] Korotkova N., Lidstrom M. E. (2001) “Connection between Poly-β-
Hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C1 and C2 compounds in the methylotrop Methylobacterium extorquens AM1”, Journal of Bacteriology, Vol. 183, No. 3, pp. 1038-1046.
[53] Kutchera U., Koopmann V., Grotha R. (2002). “Plant development in the absence of epiphytic microorganisms”, Naturwisschaften, Vol. 89, pp. 319-321.
[54] Lee J. K., Kim S. Y., Kim S. U., Kim J. H. (2002) “Synthesis of cationic
polysaccharide derivatives and their hypocholesterolaemic capacity”,
Biotechnology Applied Biochemistry, Vol. 35, pp. 181-189.
[55] Lidstrom M. E., Chistoserdova L. (2002). “Plants in the pink: cytokinin
production by Methylobacterium”, Journal of bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1818.
[56] Liu Mei, Sun Zong-xiu, Zhu Jei, Xu Tong, Harman Gary E, Lorito Matteo. Enhancing rice resitance to fungal pathogens by transformation with cell wall degrading enzyme genes from Trichoderma atroviride.
Journal oj Zhejiang University Science. 2004, 5: 133 – 136)
[57] Long R. L. G. (2000). tRNA is the source of cytokinin secretion by plant- associated members of the genus Methylobacterium, Ph. D. thesis. University of Missouri, Columbia
[58] Long R. L. G., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source
of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp.”, Journal of Bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842.
[59] Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., Sundaram S, SA T. (2004). “Growth promotion and
induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp.” Bot. Bull. Acad. Sin., Vol. 45, pp. 315-324. [60] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa. A new
insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium