Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu

Sau khi ly trích DNA các con lai, tiến hành định tính và định lƣợng DNA mẫu để đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu nhằm đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR.

- Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose: nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên dƣới tác động của dòng điện một chiều, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Bên cạnh đó, tính linh động của phân tử còn phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử và nồng độ chất cấu thành gel. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hoá chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Mặt khác, để ƣớc lƣợng khối lƣợng phân tử nucleic acid trong gel agarose, ngƣời ta sử dụng Molecular Weight Ladder (MWL), là một tập hợp các trình tự DNA có khích thƣớc đã biết nên còn gọi là thang DNA (DNA Ladder).

- Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang: phƣơng pháp này không thật chính xác nhƣng cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi đã ly trích. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm cho phép xác định

nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: một đơn vị OD_260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 g/ml cho dung dịch DNA sợi đôi, 40 g/ml cho dung dịch DNA sợi đơn. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid có độ tinh sạch cao. Vì vậy, để kiểm tra độ tinh sạch ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở bƣớc sóng 280 nm. Ở bƣớc sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Tuy nhiên, các protein cũng sẽ hấp thụ một phần ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Thông thƣờng, một dung dịch nucleic acid đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm nhiều protein) khi tỷ số OD260nm/OD_280nm = 1,7 – 2,0. Khi đó ta cũng có thể tính nồng độ nucleic acid trong mẫu bằng công thức:

DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260) – (36,0*OD₂₈₀) ]* độ pha loãng.