Đánh giá tính thơm trên hạt gạo bằng phương pháp cảm quan đun cách thủy và ngửi mùi thơm (phương pháp của IRRI, 1996)
Bước 1:Chuẩn bị mẫu
Lấy khoảng 30 hạt gạo mới thu đã chà trắng cho vào ống nghiệm.
Cho 20 ml nước cất vào mỗi ống nghiệm , đậy kín ống nghiệm bằng nút cao su.
Bước 2: Đun và ngửi mùi
Đặt vào nồi chưng có nước đang sôi, để sôi 10 phút (gạo lức cần nấu 20 phút).
Sau đó đem ra để nguội, mở nút, ngửi và phân hạng mùi thơm ở 3 mức: rất thơm, thơm vừa và không mùi. Mỗi lần trắc nghiệm nên dùng giống gạo thơm để đối chứng.
So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng.
Đánh giá tính thơm qua dấu chỉ thị phân tử Bước 1: Ly trích DNA lá lúa
Ly trích DNA lá lúa được thực hiện theo quy trình CTAB (Rogers et al., 1998) có hiệu chỉnh gồm các bước sau:
Chuẩn bị mẫu: Chọn những lá lúa non khỏe không bị sâu bệnh khử trùng bề mặt bằng cồn 70%. Dùng kéo và kẹp đã khử trùng cắt nhỏ rồi cho vào cối khoảng 5g, nghiền mịn và cho vào tube.
Thêm 1ml dung dịch trích EB và 50µl SDS 10%. Ủ 65oC trong 30 phút cứ 5 phút đảo nhẹ tube 1 lần. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 700µl phần dung dịch trong vào tube mới. Thêm 700µl isopropanol vào tube. Ủ ở -20oC khoảng 30 phút. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.
Thu phần tủa. Thêm 350µl TE buffer 0,1X hòa tan phần tủa cho tan hết. Thêm 350µl CTAB buffer. Ủ 65oC trong 30 phút cứ 5 phút đảo nhẹ tube 1 lần.
Thêm 700µl chloroform:isoamylalcohol lắc đều hơi mạnh. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.
Lấy lớp thứ nhất 500µl phần dung dịch trong sang tube mới. Thêm 1ml ethanol 96% đảo nhẹ ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 13000 vòng / phút trong 10 phút.
Rữa mẫu (2 lần): Rửa bằng 700µl ethanol 70%.
Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng đến khi ethanol bay hơi hết. Hòa tan DNA bằng 100µl TE 0,1X đánh tan trữ -20oC.
Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR
Sử dụng 4 primer nhận diện gen thơm được trình bày ở bảng 2.5 Bảng 2.5 Bốn primer nhận diện gen thơm fgr
Primer Trình tự
External sense primer (ESP) 5’ TTGTTGGAGCTTGCTGATG 3’
Internal fragrant antisense primer (IFAP)
5’CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC3 Internal non-fragrant sense
primer (INSP)
5’ CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA 3’ External antisense primer
(EAP)
5’ AGTGCTTTACAAGTCCCGC 3’
Nguồn: Ghaffar, 2011.
Chuẩn bị thành phần dung dịch cho phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.6 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích
PCR mix 5µl
PCR buffer 1X 40µl
Primer 50pmol/µl 1µl mỗi primer
DNA 100-200ng 1µl
Bước 3: Chạy điện di
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel điện di polyacrylamide 6% (Basam et al., 1991).
Bước 4: Nhuộm AgNO3
Ủ trong ethanol theo tỉ lệ: ethanol: acid acetic: nước ( 30: 10:60 ml) trong 1 giờ
Tiếp tục ủ trong ethanol theo tỉ lệ : ethanol: nước (30:70 ml) trong 30 phút Lập lại bước trên ủ trong ethanol 30 phút
Bỏ ethanol, ủ trong nước 10 phút lập lại 2 lần
Sau đó ngâm gel trong dung dịch AgNO3 30 phút (0,1g AgNO3 + 100ml nước)
Sau 30 phút rửa lại bằng nước 2 lần
Ngâm mẫu vào dung dịch phản ứng 2,5g Na2CO3 + 100µ
forman dehyt. Khi xuất hiện band ngâm mẫu vào dung dịch ngừng phản ứng acid acetic 1%