2.8.1. Trên thế giới
Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm
Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng rất ít. Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện
nấm Fusarium spp. gây bệnh trên xƣơng rồng. Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm
Fusarium spp. bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là:
Ralph A. Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phƣơng pháp PCR để khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM. Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu đƣợc từ cây mẫn cảm hay kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây trồng.
Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phân biệt
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và radicis-lycopersici và loài F. oxysporum
f. sp. lycopersici gây bệnh trên cây cà chua. Bằng cách so sánh một phần trình tự của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) và
radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni, sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh. PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL. Với primer sp13, chỉ thu đƣợc từ loài FOL 1 và 3. Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu đƣợc từ loài FOL 2 và 3 đƣợc khuếch đại. Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhƣng không cho sản phẩm ở loài FOL.
Yli - Mattila T., Paavenen S. và ctv (1996), đã sử dụng phƣơng pháp Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở Phần Lan. Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR đƣợc so sánh trong nghiên cứu đa hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide và điện di trên gel agarose. Kỹ thuật isozyme đã phát hiện đƣợc 5 sự đa hình và độ tƣơng đồng là 70%, còn phƣơng pháp RAPD - PCR cho phép phân tích tất cả các dòng của F. avenaceum. Kết quả phenotype từ phân tích
RAPD - PCR đƣợc chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tƣơng đồng là 55%.
Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. basilici trên cây húng. Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA đƣợc khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f. sp.
basilici khác nhau, F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp dot blot. Một trình tự dài 1038 bp đƣợc lai DNA từ tất cả các dòng F. oxysporum f. sp.
basilici nhƣng không thu đƣợc đoạn DNA từ các dòng F. oxysporum phân lập từ các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của
F. oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F. redolens, F. tabacinum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, S. minor, và Pythium ultimum thu đƣợc từ các cây húng bị bệnh. Trình tự này đƣợc tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của
F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc thiết kế, lần lƣợt cho sản phẩm khuếch đại là 943, 382, và 330 bp. Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F. oxysporum f. sp.
basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo.
R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm
Fusarium solani f. sp. cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD. Phƣơng pháp này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F. solani f. sp.
cucurbitae loài 1 và loài 2. 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử đƣợc sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt.
Một nhóm nghiên cứu ngƣời Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA oligonucleotide và phƣơng pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum. Kỹ thuật PCR và lai phân tử đƣợc phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum. Các dữ liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer đƣợc thiết kế. Những oligonucleotide này đƣợc kiểm tra trên 16 dòng F. oxysporum và 80 dòng của 23 loài Fusarium khác hoặc của 8 loài từ giống nấm khác. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt từ các dòng F. oxysporum sử dụng các primer PFO2 và PFO3. Khi ở dƣới điều kiện cho phép, không thu đƣợc sản phẩm
PCR từ các primer này trên 80 dòng nấm khác. Probe oligonucleotide HFO1 đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp phóng xạ tự ghi và đánh giá sự khác biệt trong các thử nghiệm lai dot blot với rRNA khuếch đại bởi PCR. Dƣới điều kiện khách quan, lai probe với DNA từ các dòng F. oxysporum cho kết quả tốt.
John Paul Jone và Pat Crill (1974), nghiên cứu tính kháng bệnh héo do
Fusarium gây ra trên cây cà chua nhận thấy rằng giống M.A.160 và một số dòng khác mang gen I có khả năng kháng loài F. oxysporum f. sp. lycopersici. Một số dòng khác không mang gen này sẽ bị nhiễm bệnh.
Nhóm nghiên cứu của Matias Pasquali, Alberto Acquadro và ctv (2004), đã
nghiên cứu đề tài: Sự phát triển primer để tiến hành PCR phát hiện một loài
Fusarium oxysporum mới gây bệnh trên cây cúc Pari. Cặp primer Mg5/Mg6 có thể xác định một cách chuyên biệt 9 dòng Fusarium oxysporum đƣợc kiểm tra từ A.frutescens, khi DNA genome của nấm đƣợc sử dụng nhƣ mẫu để kiểm tra. Ngoài ra, cặp primer Mg5/Mg6 cho phép phát hiện thành công các mô gốc và rễ mang bệnh từ cây không mang triệu chứng bệnh bên ngoài.
Một nhóm nghiên cứu gồm Zhenggang Zhang và cộng sự (2005), đã sử dụng phƣơng pháp phân tử để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. niveum và
Mycosphaerella melonis nhiễm trong mẫu thực vật và đất. Với việc phát triển 2 loại PCR chuyên biệt để phát hiện nhanh và chính xác nấm gây bệnh Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis trên mẫu thực vật và mẫu đất. 2 cặp primer chuyên biệt, Fn-1/Fn-2 và Mn-1/Mn-2 đƣợc tổng hợp. Primer Fn-1/Fn- 2 single PCR khuếch đại chỉ cho band khoảng 320 bp từ F. oxysporum f. sp.niveum, và primer Mn-1/Mn-2 cho sản phẩm PCR khoảng 420 bp từ M. melonis.