3.2.1. Vật liệu
Nguồn mẫu
- Cây D. burmanni Vahl in vitro.
Hóa chất
- Silica gel (Merck) - Benzene (Trung Quốc) - Chloroform (Trung Quốc) - Ether dầu hỏa (Trung Quốc) - Diethyl ether (Trung Quốc) - Methanol (Trung Quốc)
- Thuốc thử Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).
Trang thiết bị và dụng cụ
- Thiết bị: máy cô quay chân không, tủ hút hóa chất, tủ sấy, cô ̣t sắc ký, sắc ký bản mỏng (Merck) …
3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành
Hợp chất anthraquinone đƣợc ly trích và cô lập theo quy trình của Hồ Thị Bích Tuyền (2006) [3].
Sơ đồ 3.1: Quy trình ly trích và cô lâ ̣p hơ ̣p chất anthraquin one.
Hơ ̣p chất anthraquinone sau khi ly trích và tinh chế đƣợc sƣ̉ du ̣ng làm chất tham chiếu trong các thí nghiê ̣m đi ̣nh lƣợng bằng HPLC.
Cây tƣơi
Cây khô
Bột cây
Cao thô ethanol Sấy ở 500C
Nghiền
Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ, Lọc, cô quay chân không.
Sắc ký nhanh cột khô với đơn dung môi benzene
Sắc ký cột ƣớt với hệ dung môi
ether dầu hỏa:chloroform (95:5) Phân đoạn cao benzene
Phân đoạn chứa hợp chất anthraquinone
Sắc ký bản mỏng điều chế nhiều lần Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7) Hợp chất anthraquinone
3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC
3.3.1. Vâ ̣t liê ̣u
Nguồn mẫu
- Cây D. burmanni Vahl các loa ̣i.
- Dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl tạo đƣơ ̣c từ thí nghiệm 4.
Hóa chất
- Methanol (Prolabo) - Acid acetic (Merck) - Triethylamine (Merck)
- Anthraquinone (đã đƣơ ̣c ly trích và tinh chế trong phần 3.2.)
Trang thiết bi ̣ và du ̣ng cu ̣
- Thiết bi ̣: máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), máy đánh sóng siêu âm, máy nghiền mẫu khô, tủ sấy, máy ly tâm, cân phân tích,…
- Dụng cụ: giấy lọc, đầu lọc 0,2 m, cối sứ, bao tay, khẩu trang,…
3.3.2. Phƣơng pháp
So sánh trực tiếp diện tích peak của mẫu thử với diện tích peak của mẫu anthraquinone tham chiếu tƣơng ứng có nồng độ xác định. Yêu cầu của phƣơng pháp này là việc tiến hành sắc ký HPLC mẫu tham chiếu và mẫu thử phải tiến hành trong cùng điều kiện sắc ký và về nguyên tắc thời gian thực hiện hai mẫu không cách xa nhau.
3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp
Dựa trên các thông số , điều kiện mà Quá ch Ngô Diễm Phƣơng (2006) [12] đã sử dụng để khảo sát hàm lƣợng plumbagin trong cây D. indica L bằng HPLC, chúng tôi đã chọn các điều kiện thông số thích hợp để chạy HPLC nhƣ sau:
- Cột C18 ODS-Hypersil (25 cm x 4 mm).
- Pha động: 55% methanol, 45% acid acetic (0,02 M) đƣợc điều chỉnh đến pH 6 bằng triethylamine [17].
- Nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng.
- Detector phát hiện ở bƣớc sóng ở 254 nm.
3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn
Cân chính xác khối lƣợng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt đối thành các nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành sắc ký để thu đƣợc các peak chuẩn ở các nồng độ trên. Xây dựng đƣờng chuẩn tuyến tính biểu hiện sự biến thiên của nồng độ anthraquinone theo diện tích peak.
3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone
Mục đích
- Tìm cách xử lý mẫu thích hợp cho qui trình chạy HPLC.
Bố trí nghiệm thức
- Hai mẫu đƣợc xử lý theo hai cách A và B (Sơ đồ 3.2) đƣợc đem định lƣợng bằng HPLC.
Chỉ tiêu theo dõi
- Theo dõi khả năng tạo tín hiệu trong sắc ký đồ của 2 mẫu đƣợc xử lý theo quy trình A và B.
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣợc chia thành hai nhóm.
- Một nhóm đƣợc xử lý theo quy trình A, một nhóm xử lý theo qui trình B trƣớc khi chạy HPLC (Sơ đồ 3.2).
u
3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro
Mục đích
- Xác định bộ phận cho lƣợng anthraquinone nhiều nhất.
Bố trí thí nghiệm
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro
Chỉ tiêu theo dõi
- Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh hàm lƣợng anthraquinone (% so với tro ̣ng lƣơ ̣ng khô) trong mẫu thân lá và mẫu rễ, theo công thƣ́c:
m1
Hàm lƣợng anthraquinone (%) = x 100 m2
Với:
m1: trọng lƣợng hợp chất anthraquinone trong dung dịch mẫu đem đo (mg). m2: trọng lƣợng khô mẫu đem đo (mg).
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây in vitro đƣợc chia thành hai phần: phần thân lá và phần rễ.
- Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6.
- Tiến hành định lƣợng bằng HPLC.
Mẫu định lƣợng Mẫu thân lá Mẫu rễ
3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ
Mục đích
- Bƣớc đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa sắc tố đỏ của cây và hàm lƣợng hợp chất quinone.
Bố trí nghiệm thức
Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ
Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố đỏ Mẫu không có sắc tố đỏ
Nghiê ̣m thƣ́c Y1 Y2
Chỉ tiêu theo dõi
- Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh diện tích peak, hàm lƣợng anthraquinone của hai mẫu cây có và không có sắc tố đỏ.
Phƣơng pháp tiến hành
- Cây D. burmanni đƣợc chia làm 2 loại: loại có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ.
- Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình xử lý mẫu thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6.
3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4
Mục đích.
- Định lƣợng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù.
Cách xử lý mẫu
Sơ đồ 3.3: Quy trình xử lý dịch huyền phù.
3.4. Xử lý thống kê
Số liệu thu đƣợc từ tất cả các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0.
Dịch huyền phù
Sinh khối tế bào và mô sẹo Dịch môi trƣờng Xác tế bào và mô sẹo Dịch chiết Định lƣợng bằng HPLC Lọc qua đầu lọc
0,2 m Định lƣợng bằng
HPLC Lọc qua đầu lọc
0,2 m
Đánh sóng siêu âm 30 phút Nghiền trong methanol tuyệt đối
3 lần Ly tâm
Chƣơng 4
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
4.
4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù
4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng
Tỷ lệ sống của các mẫu lớp mỏng từ cây D. burmanni trên các môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣợc ghi nhận ở bảng 4.1, và biểu đồ 4.1.
Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l)
5 10 20 30
MS 16,67 11,67 11,67 10
MS 1/2 8,33 18,33 11,67 18,33
Gamborg’s B5 13,33 20 36,67 13,33
Kết quả trích từ phụ luc 2.1
Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
Nghiệm thức T ỷ lệ m ẫ u s ố ng (% )
Nhận xét
Từ kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu tố nhƣ sau:
Về thành phần khoáng
Thống kê bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa việc sử dụng môi trƣờng Gamborg’s B5 với 2 loại môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS, với tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới chọn môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera [12], [23].
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Loại môi trƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng
MS MS 1/2 Gamborg’s B5 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8 9,10,11, 12 12,50 a 14,17a 20,83 b
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).
Về nồng độ đƣờng
Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lớp mỏng sống và phát triển đƣợc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng quá cao và quá thấp mẫu mô đều chết. Một đặc điểm thƣờng gặp ở phƣơng pháp lớp mỏng tế bào là mẫu mô khá nhạy cảm với áp suất thẩm thấu. Ghi nhận thực tế cho thấy, khi sử dụng nồng độ đƣờng cao các mẫu mô sẽ bị chết đen và có xu hƣớng hơi co lại do mất nƣớc.
Bên cạnh đó, kết quả bảng 4.1 và biểu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hợp sử dụng loại môi trƣờng MS 1/2 với nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11 (36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l).
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng 5 10 20 30 1, 5, 9 2, 6, 10 3, 7, 11 4, 8, 12 12,78 a 16,67 b 20,00 c 13,89 ab
Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05).
Nhƣ vậy khi kết hợp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chúng tôi chọn đƣợc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lớp mỏng cây bắt ruồi là môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l.
4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo
Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni vahl trên môi trƣờng có nồng độ đƣờng và thành phần khoáng chọn từ thí nghiệm 1, bổ sung các loại hormone khác nhau đƣợc ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng có kết hợp 2 loại hormone khác nhau Các loại hormone
kết hợp (mg/l) NAA (0,2) 2,4-D (0,1) NAA (0,5) IBA (1) NAA (1) BA (0,2)
Tỷ lệ mẫu tạo sẹo 25,17 c 2,93 b 0 a
Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0,05).
Nhận xét
Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong đó sự kết hợp 2 loại NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không có sự tạo thành mô sẹo mà chỉ có sự hình thành chồi trực tiếp từ các mẫu thân) và sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất (25,56%).
Sự kết hợp cùng lúc 2 loại auxin để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera đã đƣợc ghi nhận trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣớc [12], [23], [28]. Thông thƣờng mô sẹo đƣợc tạo thành khi có sự tác động đồng thời của cả 2 loại hormone auxin và cytokinin, trong đó hàm lƣợng auxin nhiều hơn. Tuy nhiên ở một số đối tƣợng, lƣợng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣợng lớn hơn auxin để cảm ứng hình thành mô sẹo.
Tổng hợp các ghi nhận và phân tích, chúng tôi chọn sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô sẹo từ lớp mỏng các bộ phân cây D. burmanni Vahl.
4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơ ̣p của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo
Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy
Loại vật liệu đầu Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo
Hình thái mô sẹo
Phát hoa
C1 0 5,53 Mô sẹo hơi phình, đặc. (Hình 4.1A)
C2 0,1 22,23 Mô sẹo xốp, đỏ, ít. (Hình 4.1B)
C3 0,2 52,77 Mô sẹo xốp, vàng xanh, phình to (Hình 4.1C).
C4 0,3 36,10 Mô sẹo xốp, vàng xanh. C5 0,4 19,47 Mô sẹo hơi chai.
C6 0,5 22,23 Mô sẹo chai cứng (Hình 4.1D).
Thân C1’ 0 0 Mẫu cấy hóa nâu.
C2’ 0,1 38,90 Mô sẹo vàng xanh, phần mẫu cảm ứng ít (Hình 4.2A).
C3’ 0,2 72,23
Mô sẹo xốp , vàng trắng có ít đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B, E).
C4’ 0,3 55,53 Mô sẹo xốp, vàng xanh vài mẫu có đốm đỏ
C5’ 0,4 50 Mô sẹo vàng trắng, có đốm đỏ hơi đặc . (Hình 4.2C).
C6’ 0,5 22,23 Mô sẹo vàng xanh, hơi chai cứng (Hình 4.2D).
Lá
C1” 0 8,30 Mô sẹo đỏ, phần mẫu cảm ƣ́ng ít (Hình 4.1E)
C2” 0,1 16,70 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh nhƣng ít.
C3” 0,2 27,77 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh, phình to (Hình 4.1F).
C4” 0,3 22,23 Mô sẹo đă ̣c, màu vàng xanh xen đốm đỏ (Hình 4.1G)
C5” 0,4 13,90 Mô sẹo vàng xanh có đốm đỏ , hơi chai cứng.
C6” 0,5 13,90 Mô sẹo đỏ, chai cứng. (Hình 4.1H)
Kết quả được trích từ phụ lục 2.3
Nhận xét
Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối với cả 3 loại vật liệu đầu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đều thấp nhất ở nghiệm thức có môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất ở cả 3 loại mẫu: 52,77% ở mẫu phát hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu lá TCL.
Các auxin đƣợc biết đến là có khả năng kích thích mạnh sự phân chia tế bào, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ loại hormone sơ cấp để sản xuất mô sẹo. Các auxin thông dụng hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D có mức độ ảnh hƣởng tăng dần, trong đó 2,4-D là chất sử sụng hiệu quả nhất trong trong việc hình thành mô sẹo [16]. Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tạo mô sẹo xốp hơn là NAA. Điều này có lẽ là do 2,4-D cảm ứng sự phân chia tế bào mạnh, các tế bào phân chia liên tục trong thời gian ngắn không kịp để tổng hợp vật chất nên nó thƣờng lỏng lẻo. Vì mục đích thí nghiệm là tạo mô sẹo để nuôi dịch huyền phù về sau (cần mô sẹo xốp) và do không đủ thời gian để dò nồng độ của cả hai loại hormone, chúng tôi chọn 2,4-D là loại hormone chính để tạo mô sẹo.
Bên cạnh đó bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, các mẫu lớp mỏng từ lóng thân cho tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất trong khi các mẫu lá thấp nhất. Kết quả này có lẽ là do đặc điểm hình thái của cây D. burmanni Vahl: bề mặt lá của chúng mang nhiều tua cuốn khiến chúng khó tiếp xúc với môi trƣờng; các tua cuốn này lại chứa chất nhầy và nhiều loại enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến các mẫu mô.
Với những nhận xét trên, chúng tôi chọn nồng độ kết hợp tối ƣu cho việc tạo mô sẹo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho mọi loại vật liệu đầu từ lớp mỏng cây D. burmanni Vahl.
Phát hoa TCL A: 2,4-D (0 mg/l) B: 2,4-D (0,1 mg/l) C: 2,4-D (0,2 mg/l) D: 2,4-D (0,5 mg/l) Lá TCL E: 2,4-D (0 mg/l) F: 2,4-D (0,2 mg/l) G: 2,4-D (0,3 mg/l) H: 2,4-D (0,5 mg/l)
Hình 4.1: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng cây
Hình 4.2: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi: A: 0,1 mg/l B: 0,2 mg/l C: 0,4 mg/l D: 0,5 mg/l
E: 0,2 mg/l (quan sát dƣới KHV 10 X)
4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù