2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại Giới : Fungi Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae Giống : Aspergillus
Loài : Aspergillus oryzae
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành bào tử : 45%. Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%. Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trƣờng : 5,5 - 6,5. Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối với vi khuẩn.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng
enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trƣờng còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trƣờng, trong lòng môi trƣờng.
+ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45o
C.
+ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
+ Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn.
+ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease
Quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tóm tắt nhƣ sau : Chế phẩm enzyme thô Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Tinh chế kết tủa bằng sắc ký lọc gel
Kiểm tra độ tinh sạch, xác định trọng lƣợng
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lƣợng chế phẩm enzyme thô đã sấy đƣợc đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chƣa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nƣớc nên sau khi nghiền mịn, ngƣời ta dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nƣớc trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong nƣớc chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lƣơng Đức Phẩm, 1998)
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly : Tỷ lệ nƣớc trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nƣớc để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nƣớc trên chế phẩm khác nhau sẽ trích đƣợc lƣợng enzyme khác nhau. Lƣợng nƣớc dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lƣợng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nƣớc, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích đƣợc nhiều enzyme hơn nhƣng làm tăng lƣợng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhƣng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C.
Để tăng cƣờng khả năng thu enzyme, chế phẩm đƣợc đánh tơi trƣớc khi trích để đạt đƣợc kích thƣớc hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thƣờng dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme tinh khiết
trích đƣợc nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lƣợng enzyme trong dịch chiết thu đƣợc.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt. Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau. Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thƣờng gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp.
Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó cũng đƣợc sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn có khuynh hƣớng kết tủa trƣớc, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhƣ vậy với quá trình này ta có thể thu đƣợc protein mong muốn một cách tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng. Điều này có đƣợc bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nƣớc (nhƣ acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tƣơng đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phƣơng pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nƣớc lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tƣợng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lƣu ý đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thƣờng mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Ngƣời ta thƣờng tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký
Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography) o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC)
Kích thƣớc Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học
(tính đặc hiệu của ligand)
Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đƣa vào thị trƣờng sản phẩm thƣơng mại SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phƣơng pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật này dùng để tách những phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu đƣợc phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thƣớc. Sự phân tách nhóm đƣợc sử dụng để loại các phân tử lớn hay các phân tử tạp chất nhỏ (nhƣ đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu đƣợc phân tách theo sự khác biệt về kích thƣớc phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể đƣợc dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lƣợng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lƣợng phân tử.
Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel a) Ƣu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối.
b) Nhƣợc điểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phƣơng pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lƣợng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000