KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thu thập mẫu tại các vùng trồng điều thuộc tỉnh Ninh Thuận
(2 4: 1) Dịch lỏng màu xanh
Cặn (bỏ)
+ 500 ul chloroform : isoamyl alcohol
(24 : 1) Dịch lỏng màu xanh Dịch lỏng màu xanh Dịch lỏng màu xanh nhạt Cặn (bỏ) vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C vortex 10 phút, ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 2 ul RNase ủ 370 C/1 giờ Isopropanol lạnh (1 : 1) Dịch lỏng màu xanh nhạt có huyền phù
(tủa ở -200 C qua đêm) Tủa trắng đục ly tâm 5 phút/14000 vòng/100 C + 300 ul TE 1X ủ 370 C/1 giờ Dung dịch trắng đục + 20 ul Sodium acetate 3 M, 640 ul Ethanol 100% Dung dịch trắng đục có huyền phù (để - 200 C / 30 phút) ly tâm 10 phút/14000 vòng/100 C Dịch lỏng màu xanh nhạt Hình 4.1 : Quy trình ly trích DNA
Quy trình ly trích sử dụng 2-mercaptoethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ được tạp chất như protein, polysaccharide...qua đó chất lượng DNA thu được tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học.
Chúng tôi thực hiện ly trích 55 mẫu, thu được DNA ở 50 mẫu đạt tiêu chuẩn dùng cho các kỹ thuật phân tử, chiếm 90,9%. Trong 50 mẫu thu được có 52% số mẫu đạt DNA tinh sạch có OD > 1,8 và 80% số mẫu có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. Trong đó có 44% số mẫu vừa có OD > 1,8 vừa có hàm lượng DNA lớn hơn 50 ng/ul. (kết quả chi tiết ở bảng 4.2 phần phụ lục II).
Đối với 5 mẫu ly trích thu được DNA không đạt đều là 5 mẫu lá non, có thể do lá non chứa nhiều nhựa và các hợp chất phenol nên khi loại bỏ các tạp chất đồng thời mất đi một lượng DNA đáng kể. Do đó kết quả ly trích lá non thu được lượng DNA rất thấp, không đủ tiêu chuẩn để thực hiện RAPD – PCR. Như vậy thích hợp nhất cho việc ly trích là lá trưởng thành.
Hình 4.2: Các mẫu DNA ly trích
12, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 29: NH12 – NH29; 7 – 10: NP7 – NP10; 38, 39, 41: NS38 – NS41; 42, 50: BA42, BA50 38, 39, 41: NS38 – NS41; 42, 50: BA42, BA50
Qua hình 4.2 chúng tôi nhận thấy việc ly trích theo hình 4.1 là tương đối phù hợp, mặc dù kết quả điện di cho thấy có hiện tượng DNA bị gãy (gel bị smear) nhưng kết quả đo OD tương đối tốt và hàm lượng DNA cũng khá cao (trung bình 108 ng/ul).
Trong quá trình ly trích chúng tôi nhận thấy một số vấn đề sau:
Lúc cân mẫu chuẩn bị nghiền, tránh để lá điều thoát hơi nước, nếu không việc ly trích DNA sẽ không đạt hiệu quả thậm chí không có DNA. Do sự thoát hơi nước tự nhiên làm lá điều bị khô, các mô bị tổn thương dẫn đến sự hư hỏng DNA. Có thể dùng bịch nylon để đựng mẫu sau khi cân hoặc dùng giấy gói lại, tuy nhiên dùng bịch nylon hiệu quả hơn
Dịch trích EB khi bảo quản thường có hiện tượng kết tủa (CTAB) ảnh hưởng đến hiệu quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C khoảng 5 phút trước khi sử dụng
Quá trình nghiền ảnh hưởng đến sự đứt gãy DNA, do đó khi nghiền tránh tạo bọt và không nghiền quá mạnh
Ở các bước cho TE vào hòa tan DNA không nên khuấy bằng vortex (khuấy bằng vortex DNA sẽ gãy). Nếu ủ ở 370
C trong 30 phút mà DNA chưa tan hết thì ủ ở thời gian lâu hơn
Khuấy trộn nhẹ, kỹ để tránh gãy DNA, thường khuấy bằng vortex khoảng 800 – 900 vòng
Ở bước 3 và bước 4 khi chuyển lấy dịch trong cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dưới, nếu không độ tinh sạch sẽ không cao. Thường bước 3 hút khoảng 450 ul và bước 4 hút khoảng 300 ul
Ở bước 11 khi để khô cặn cần chú ý, nếu để quá khô sẽ làm hỏng DNA, nếu còn ethanol sẽ ảnh hưởng xấu đến DNA trong quá trình bảo quản và phản ứng PCR.