chất khỏc từ chi Alpinia (Zingiberaceae)
Cỏc thành phần húa học khỏc thường được phỏt hiện trong cỏc thực vật chi Alpinia (Zingiberaceae) là cỏc hợp chất mono- và sesquitecpenoit trong cỏc tinh dầu từ cỏc bộ phận lỏ, thõn, rễ và quả. Cỏc đitecpenoit dóy labdan thường được phõn lập và cỏc hợp chất này cho cỏc hoạt tớnh gõy độc tế bào mạnh.
Cỏc tinh dầu từ lỏ khụ, thõn giả và thõn rễ loài Alpinia conchigera Griff. được thu nhập từ tỉnh Jeli của Kelanta, bờ biển phớa đụng của bỏn đảo Malaysia, đó nhận được bằng chưng cất lụi cuốn hơi nước. Phõn tớch GC và GC-MS đó nhận biết được 41 hợp chất, trong đú 13 thành phần đó được xỏc định lần đầu tiờn. Ở lỏ, thõn giả và thõn rễ 40, 33 và 39 thành phần đó được xỏc định. Thành phần phổ biến nhất trong tinh dầu lỏ là β-bisabolen (15,3%),
β-pinen (8,2%), β-sesquiphellandren (7,6%), chavicol (7,5%) và β-elemen (6,0%), trong khi β-bisabolen (19,9%), β-sesquiphellandren (11,3%), β- caryophyllen (8,8%) và β-elemen (4,7%), là cỏc hợp chất chớnh trong tinh dầu thõn giả. Trong tinh dầu thõn rễ, 1,8-cineol (17,9%), β-bisabolen (13,9%), β- sesquiphellandren (6,8%) và β-elemen (4,0%) là cỏc hợp chất chớnh. Cỏc tinh dầu đó được thử nghiệm hoạt tớnh khỏng nấm và khỏng khuẩn, tuy nhiờn chỉ cú cỏc sự ức chế yếu đối với cỏc vi sinh vật thử nghiệm đó được phỏt hiện [29].
Trong liệu phỏp điều trị thực vật, tinh dầu từ lỏ cõy Alpinia zerumbet
(Alpinia speciosa K. Schum.) đó được sử dụng cho điều trị cỏc triệu chứng của bệnh thần kinh, như sự giảm thần kinh, stress, lo lắng, và cỏc bệnh về kinh niờn liờn quan đến sự mất cõn bằng hoocmon sinh sản ở phụ nữ. Thành
phần hoỏ học của tinh dầu đó được phõn tớch bằng GC-MS. Cỏc tớnh chất của tinh dầu gõy ra sự thay đổi hành vi của chuột đó được nghiờn cứu bởi cỏc quan sỏt hành vi và bài toỏn mờ cung nõng cao (EPM) được sử dụng làm phương phỏp để đỏnh giỏ cỏc biểu hiện giảm căng thẳng. Năm hợp chất chớnh,
p-cymen (28,0±5%), 1,8-cineol (17,9±4,2%), terpinen-4-ol (11,9± 6,3%), limonen (6,3±2,2%) và camphor (5,2±2,1%) đó được xỏc định bằng GC và GC-MS. Đưa tinh dầu vào bằng đường hớt (8,7 ppm) đó dẫn phản ứng nhảy duy nhất ở chuột. Để nghiờn cứu cỏc cơ chế điều chỉnh hành vi của tinh dầu, 10 mg/kg 5-HTP hoặc 10 mg/kg fluoxetine đó được tiờm vào đường màng bụng trước khi cho hớt tinh dầu. Bằng cỏc xử lý trước với 5-HTP hoặc fluoxetine, tần số nhảy đó giảm đỏng kể. Trong thớ nghiệm EPM, tinh dầu (0,087 và 8,7 ppm) đó cho thấy rừ hoạt tớnh giảm căng thẳng ở chuột [19].
Kỹ thuật HSCCC bỏn điều chế đó được ỏp dụng thành cụng trong phõn lập và tinh chế nootkaton (59) từ tinh dầu quả Alpinia oxyphylla Miquel. Mười hai hệ dung mụi 2 pha, bao gồm cú 7 hệ khụng nước và 5 hệ hữu cơ nước- dung mụi hữu cơ, với hệ số phõn bố phự hợp của nootkaton mà cũn hệ số tỏch thớch hợp giữa nootkaton và valencen, tạp chất chủ yếu trong tinh dầu. Hơn nữa trong HSCCC, n-hexan-clorofom-axetonitril (10:1:10, v/v), và n-hexan- metanol-nước (5:4:1, v/v) đó được sàng lọc riờng biệt. Tuy nhiờn, n-hexan- metanol-nước (5:4:1,v/v) được cho là tối ưu vỡ thời gian rửa giải rất ngắn và cỏc dạng pic HSCCC tốt hơn. Bằng cỏch rửa giải pha dưới của hệ dung mụi trong phương thức đầu-đuụi, 3,1 mg nootkaton đó nhận được với độ tinh khiết 92,3% (GC-MS) từ 80 mg tinh dầu thụ trong thao tỏc một bước với thời gian ớt hơn 4 giờ [24].
O
59
Nghiờn cứu hoỏ học phần chiết CHCl3 từ hạt Alpinia zerumbet đó phõn lập được 2 labdan đitecpen mới (60 và 61) cựng với năm hợp chất đó biết (62-66). Tất cả cỏc chất được phõn lập đó được thử nghiệm hoạt tớnh gõy độc tế bào trờn cỏc dũng tế bào ung thư THP-1, HL-60, A-375 và A-549. Hai hợp chất 60 và 61 thể hiện hoạt tớnh gõy độc tế bào mạnh [23].
O CHO OH O O H OH OH O H OH O OH H H HO O O OH 60 61 62 H O H O O OHC OH 63 64
OH O OH O
OH
CHƯƠNG II
NHIỆM VỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1 Nhiờm vụ nghiờn cứu
Luận văn này nghiờn cứu thành phần hoỏ học của cõy Alpinia pinnanensis T. L. Wu et Senjen (Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen) (Zingiberaceae) được thu thập ở Lào Cai.
Nhiệm vụ được đề ra cho nghiờn cứu trong luận văn này gồm cú:
1. Xõy dựng quy trỡnh chiết cỏc hợp chất hữu cơ thiờn nhiờn cú từ thõn rễ cõy
Alpinia pinnanensis;
2. Phõn tớch sắc ký lớp mỏng (TLC) cỏc phần chiết để định tớnh cỏc phần chiết và xỏc định cỏc hệ dung mụi thớch hợp cho phõn tỏch sắc ký cột;
3. Phõn tỏch cỏc phần chiết và phõn lập cỏc hợp chất thành phần chớnh bằng cỏc phương phỏp sắc ký điều chế;
4. Xỏc định cấu trỳc cỏc hợp chất được phõn lập bằng cỏc phương phỏp phổ hiện đại.
5. Đỏnh giỏ hoạt tớnh chống oxy húa của cỏc hợp chất phenolic nhận được.
2.2 Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1 Cỏc phương phỏp xử lý mẫu và chiết
Mẫu thực vật sau khi được thu hỏi được rửa sạch, thỏi nhỏ và phơi khụ trong búng rõm, sau đú sấy ở 40oC và xay thành bột mịn. Bột nguyờn liệu thực vật được ngõm chiết với dung mụi axeton ở nhiệt độ phũng. Phần chiết axeton nhận được được phõn bố chọn lọc bằng phương phỏp chiết hai pha lỏng lần lượt vào cỏc dung mụi cú độ phõn cực tăng dần, n-hexan, điclometan và etyl axetat.
2.2.2 Cỏc phương phỏp phõn tớch, phõn tỏch cỏc hỗn hợp và phõn lập cỏc hợp chất hợp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phõn tớch định tớnh cỏc phần chiết, định hướng phõn tỏch cỏc phần chiết, đặc trưng cỏc hợp chất và kiểm tra độ sạch của cỏc hợp chất phõn lập.
Sắc ký cột được thực hiện trờn chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phõn tỏch cỏc phần chiết, phõn lập và tinh chế cỏc hợp chất thiờn nhiờn.
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung mụi. Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới ỏp suất khụng khớ nộn.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được sử dụng để tinh chế lượng nhỏ (< 15 mg) chất hữu cơ.
Phương phỏp kết tinh để tinh chế cỏc chất rắn.
2.2.3 Cỏc phương phỏp nghiờn cứu cấu trỳc
Cấu trỳc của cỏc hợp chất được xỏc định bằng cỏch kết hợp cỏc phương phỏp phổ:
Phổ hồng ngoại (IR);
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS);
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn proton (1H-NMR);
Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trỡnh DEPT.
2.3 Phương phỏp đỏnh giỏ hoạt tớnh chống oxi húa
Cỏc hợp chất phenolic được phõn lập đó được đỏnh giỏ hoạt tớnh chống oxi húa in vitro theo phương phỏp quột gốc tự do DPPH của S. G. Olga et al. (2003).
Thử nghiệm hoạt tớnh chống oxi húa được thực hiện tại Phũng Sinh học thực nghiệm, Viện Húa học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, Viện Khoa học và cụng nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG III
PHẦN THỰC NGHIỆM
3.1 Thiết bị và hoỏ chất - Cỏc phương phỏp sắc ký - Cỏc phương phỏp sắc ký
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng trỏng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với lớp silica gel dày 0,2 mm trờn nền nhụm. Phỏt hiện vệt chất bằng dung dịch vanilin/H2SO4 đặc 1% sau đú hơ núng bản mỏng ở 1200 và đốn tử ngoại ở bước súng λ = 254 nm.
Sắc ký cột thường (CC)
Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung mụi. Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel cỡ hạt 63-200 àm (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).
Sắc ký cột nhanh (FC)
Phõn tỏch sắc ký cột nhanh được thực hiện dưới ỏp suất nộn. Chất hấp phụ cho FC là silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 μm và 63-100 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức).
Cỏc cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich) cú đường kớnh khỏc nhau được sử dụng tựy theo khối lượng mẫu cần phõn tỏch.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C)
Phõn tỏch sắc ký cột tinh chế được sử dụng để tinh chế cỏc hợp chất hữu cơ. Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. ì 10 cm) được nhồi silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 μm) (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) được sử dụng cho Mini-C.
- Cỏc phương phỏp phổ
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS)
Phổ EI-MS được đo trờn thiết bị HEWLETT PACKARD 5989-MS Engine và Waters Autospec Premier.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR)
Cỏc phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được ghi trờn thiết bị Bruker Avance 500 với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoỏ học δ được biểu thị bằng ppm. Tớnh bội của cỏc tớn hiệu 13C được xỏc định trờn cơ sở cỏc phổ DEPT 90 và DEPT 135.
3.2 Nguyờn liệu thực vật
Thõn rễ tươi cõy Alpinia pinnanensis T. L. Wu et S. J. Chen (Zingiberaceae) (20 kg) đó được nhà thực vật học, ThS. Nguyễn Quốc Bỡnh (Viện Sinh thỏi và Tài nguyờn Sinh vật, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam) thu thập vào thỏng 11 năm 2007 tại xó Liờm Phỳ, Văn Bàn, Lào Cai.
Mẫu sau đú được rửa sạch, thỏi lỏt mỏng, phơi khụ trong búng rõm và sấy khụ ở 40oC. Mẫu khụ (1,6 kg) được xay thành bột mịn.
3.3 Điều chế cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
Mẫu bột khụ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis (1,6 kg) được ngõm chiết trong dung mụi axeton ở nhiệt độ phũng. Sau 3 ngày tiến hành lọc, thu được dịch chiết axeton đầu tiờn. Tiến hành lặp lại quỏ trỡnh ngõm mẫu trong axeton thờm 4 lần nữa. Cuối cựng lọc bỏ bó thực vật thu được dịch chiết axeton. Dịch chiết sau 5 lần ngõm chiết được gộp lại và được cất loại kiệt dung mụi dưới ỏp suất giảm ở nhiệt độ từ 40 – 50oC để trỏnh làm biến chất cho đến khi thu được phần chiết axeton là một cặn tương đối sệt.
Hoà loóng phần chiết axeton này trong nước cất và lần lượt chiết dịch nước nhận được với cỏc dung mụi n-hexan, điclometan và etyl axetat. Cỏc
dịch chiết nhận được được làm khan bằng Na2SO4 sau đú được cất loại kiệt dung mụi dưới ỏp suất giảm ở nhiệt độ 50oC, thu được cỏc phần chiết tương ứng ký hiệu là AP1 (phần chiết n-hexan), AP2 (phần chiết điclometan) và
AP3 (phần chiết etyl axetat).
Quy trỡnh điều chế cỏc phần chiết được nờu trờn Sơ đồ 1, Mục 4.2; Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
Xỏc định khối lượng cỏc phần chiết và tớnh hiệu suất so với lượng mẫu khụ ban đầu. Kết quả được trỡnh bày ở Bảng 2.
Bảng 2: Hiệu suất điều chế cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis
STT Phần chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) 1 n-Hexan AP1 21,1 1,32
2 Điclometan AP2 49,2 3,01 3 Etyl axetat AP3 3,8 0,23
3.4 Phõn tớch thành phần cỏc phần chiết bằng phương phỏp sắc ký lớp mỏng (TLC) lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trờn bản mỏng silica gel trỏng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) trờn nền nhụm. Tuỳ từng phần chiết mà lựa chọn trong cỏc hệ dung mụi triển khai khỏc nhau để cho cỏc sắc ký đồ phõn giải tốt cỏc hợp chất trong cỏc phần chiết từ thõn rễ cõy Alpinia pinnanensis.
3.4.1 Phần chiết n-hexan (AP1)
Phõn tớch sắc ký lớp mỏng phần chiết n-hexan (AP1) được thực hiện với cỏc hệ dung mụi triển khai n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC phần chiết n-hexan được trỡnh bày ở Bảng 3, Mục 4.3.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.4.2 Phần chiết điclometan (AP2)
Phần chiết điclometan (AP2) được phõn tớch TLC với cỏc hệ dung mụi
n-hexan-axeton (tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1, v/v). Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC được phần chiết điclometan trỡnh bày trờn Bảng 4, Mục 4.4.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.4.3 Phần chiết etyl axetat (AP3)
Phần chiết etyl axetat (AP3) được phõn tớch với TLC với cỏc hệ 3 dung mụi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với cỏc tỷ lệ 20:19:1, 20:15:1 và 20:19:0,5, hệ etyl axetat-axit fomic-nước với tỷ lệ 30:2:3, và hệ etyl axetat- metanol-nước với tỷ lệ 30:5:4. Phỏt hiện cỏc vệt chất trờn bản mỏng bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc 1% và FeCl3 5%.
Cỏc kết quả phõn tớch TLC được trỡnh bày trờn Bảng 5, Mục 4.5.1, Chương 4: Kết quả và Thảo luận.
3.5 Phõn tỏch sắc ký cỏc phần chiết và phõn lập cỏc hợp chất
3.5.1 Phõn tỏch phần chiết n-hexan (AP1)
Phần chiết n-hexan AP1 (10 g) được hoà tan trong CH2Cl2 sau đú được hấp phụ trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm). Khuấy đều cho đến khi silica gel hấp phụ đều hết dung dịch mẫu cho đến khi khụ đều.
Cho silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) vào n-hexan và khuấy đều cho đến khi hết bọt khớ. Sau đú đổ silica gel ở dạng bột nhóo vào cột sắc ký (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Cho dung mụi n-hexan đi qua cột nhiều lần để nộn đều cột đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu đó tẩm trờn silica gel lờn cột CC. Rửa giải cột sắc ký gradient bằng hệ dung mụi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v). Cỏc phõn đoạn được thu theo 50 ml/phõn đoạn. Kiểm tra quỏ trỡnh rửa giải sắc ký bằng TLC, kết quả thu được 24 nhúm phõn đoạn được ký hiệu từ AP1.1 đến
AP1.24.
Cỏc nhúm phõn đoạn AP1.11 (150 mg) và AP1.12 (670 mg) được rửa nhiều lần bằng n-hexan cho chất AP1.11 (101 mg) và AP1.12 (203 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Nhúm phõn đoạn AP1.15 (44 mg) được rửa bằng n-hexan cho chất
AP1.15 (25 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu trắng nhạt.
Nhúm phõn đoạn AP1.18 (1,1 g) được phõn tỏch sắc ký CC (2 cm i.d. x 20 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm) với hệ dung mụi gradient n-
hexan-axeton 6:1 đến 1:1 cho chất AP1.18.3 (321 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu vàng nhạt.
Nhúm phõn đoạn AP1.20 (1,13 g) được cho chạy sắc ký cột CC (2 cm i.d. x 25 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm), hệ dung mụi gradient
n-hexan-axeton 7:1 và 5:1 cho năm nhúm phõn đoạn chớnh sau cỏc phõn tớch TLC từ AP1.20.1 đến AP1.20.5. Cỏc nhúm phõn đoạn AP1.20.3 và AP1.20.4
được gộp lại và phõn tỏch CC (2 cm i.d. x 20 cm) với gradient n-hexan-axeton 7:1, 5:1 và 3:1 (silica gel Merck cỡ hạt 40-63 àm). Kết quả thu được chất
AP1.20.3.2 (356 mg) dưới dạng tinh thể hỡnh kim màu vàng ỏnh.
Nhúm phõn đoạn AP1.22 (190 mg) được rửa bằng axeton cho chất
AP1.22 (23 mg)dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Phần chiết điclometan AP2 (4,1 g) được hoà tan trong một lượng vừa đủ CH2Cl2 và được tẩm trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-200 àm) cho một hỗn hợp bột mịn màu vàng.
Nhồi cột ướt silica gel (Merck, cỡ hạt 40-63 àm) vào cột phõn tỏch CC (Φ = 3 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm. Đưa phần chiết tẩm silica gel lờn cột, rửa giải gradient bằng hệ dung mụi n-hexan-axeton 9:1, 6:1, 3:1 và 1:1 (v/v), thu cỏc phõn đoạn theo 50 ml/phõn đoạn. Kiểm tra quỏ trỡnh phõn tỏch bằng TLC. Kết quả thu được 21 nhúm phõn đoạn được ký hiệu từ AP2.1 đến AP2.21.
Nhúm phõn đoạn AP2.11 (200 mg) ở dạng gel được chạy CC (2 cm i.d. x 20 cm) trờn silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm) với hệ dung mụi n-hexan- axeton 6:1, thu được chất AP2.11.3 dưới dạng gel màu vàng. Tinh chế tiếp
AP2.11.3 với cột CC (1,5 cm i.d. x 20 cm) với hệ điclometan-axeton 25:1, thu được chất AP2.11.3.3 (83 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
Nhúm phõn đoạn AP2.16 (150 mg) được kết tinh trong hệ dung mụi n-
hexan-axeton cho chất AP2.16 (135 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu vàng.
Nhúm phõn đoạn AP2.17 (18,7mg) và AP2.18 (18,7mg) được rửa bằng CH2Cl2 cho cỏc chất AP2.17 (15,6 mg) và AP2.18 (3,1 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
3.5.3 Phõn tỏch phần chiết etyl axetat (AP3)
Phần chiết etyl axetat AP3 (3,8 g) được hoà tan vừa đủ trong metanol và được tẩm với silica gel (Merck, cỡ hạt 63-100 àm) cho một chất bột mịn màu vàng.
Nhồi silica gel theo phương phỏp nhồi cột ướt vào cột tỏch CC (Φ = 2,5 cm i.d.) đến chiều cao 30 cm.
Đưa mẫu tẩm silica gel lờn cột, rửa giải gradient bằng hệ 3 dung mụi
n-hexan-etyl axetat-axit fomic, thu cỏc phõn đoạn theo 20 ml/phõn đoạn cho 13 nhúm phõn đoạn chớnh được ký hiệu từ AP3.1 đến AP3.13.
Chất AP3.4 (87 mg) được tỏch ra từ nhúm phõn đoạn AP3.4 (96 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu vàng.
Nhúm phõn đoạn AP3.13 (0,67 g) được rửa bằng n-hexan và axeton cho chất AP3.13 (63 mg) dưới dạng bột vụ định hỡnh màu trắng.
3.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của cỏc hợp chất được phõn lập
β-Sitosterol (AP1.11)
Bột vụ định hỡnh màu trắng.
Rf = 0,24 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v/v). Hiện màu tớm với thuốc thử vanillin/H2SO4 đặc 1%.