Thiết bị quan trọng nhất dùng cho phương pháp PCR là máy luân nhiệt. Yêu cầu quan trọng nhất của thiết bị này là việc thay đổi nhiệt độ phải diễn ra nhanh và chính xác. Ngoài ra, các eppendorf dùng cho phản ứng phải cùng một kiểu.
2.4. Phƣơng pháp RT - PCR
RT-PCR ( reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA; sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA.
2.4.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy thuộc vào mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết vào nhiều vị trí trên mRNA
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngƣợc
Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược vào năm 1970 đã giải thích tại sao bộ gene RNA của virus tạo khối u có thể chuyển thành dạng DNA trong tế bào bị nhiễm.
Ngày nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp cDNA
Enzyme phiên mã ngược của avian myeloblastosis virus (AMV) và dòng Moloney của virus murine leukemia (Mo-MLV). Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi primer sử dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có nhóm 3’ OH. Loại enzyme này không có hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease. Khi sử dụng loại enzyme này đòi hỏi trong phản ứng phải có nồng độ dNTP cao.
- Enzyme được mã hóa bởi AMV, có hoạt tính RNase nên có thể cắt nửa phần của RNA-DNA và có thể dính chặt vào đầu 3’ của sợi DNA nếu phản ứng phiên mã ngược bị dừng lại giữa chừng trong quá trình tổng hợp (dẫn liệu từ Rotawicz và cộng sự,1988).Vì vậy sự hoạt động ở mức độ cao của RNase H cùng với việc phiên mã ngược có xu hướng ngặn chặn việc tạo ra cDNA và làm giảm chiều dài của nó.
- Enzyme murine phù hợp cho RT-PCR hơn vì hoạt tính RNase của nó yếu hơn. Tuy nhiên, Mo-MLV sẽ hoạt động tối ưu ở điều kiện nhiệt độ thấp (370C) hơn so với enzyme AMV (420C), chính đặc điểm này làm cho Mo-MLV không thuận lợi trong các phản ứng mà RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Những dạng biến thể của enzyme phiên mã ngược Mo-MLV không có hoạt tính RNase: nhiều dạng enzyme loại này đã được thương mại hóa, chúng có thể được sử dụng để biến đổi một lượng mẫu lớn và tổng hợp cDNA dài hơn so với các dòng hoang dại ( dẫn liệu từ Gerard và cộng sự. 1988). Thêm vào đó, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ cao (trên 500C), điều này sẽ thuận lợi khi RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn chịu
nhiệt Thermus thermophilus. Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có sự
hiện diện của Mn2+
(Myers và Gelfand, 1991. dẫn liệu). Đặc điểm thuận lợi của loại enzyme này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube phản ứng . Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1- 2 kb, thêm vào đó việc sử dụng Mn2+ trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp cDNA có độ đặc hiệu thấp. Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT và random hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại đó enzyme phiên mã ngược hoạt động.
2.4.3 Các primer trong phiên mã ngƣợc
Có ba loại primer thường được sử dụng cho quá trình phiên mã ngược của phản ứng RT-PCR.
Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là thường tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’. Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược, primer oligo T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Mồi oligo T thường được sử dụng như là một “mồi phổ dụng” cho việc tổng hợp ra một cDNA thông thường.
Oligonucleotide antisense: Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình tự đích đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên, khi sử dụng oligonucleotide làm mồi cho quá trình phiên mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết kế sao cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của oligonucleotide sử dụng làm primer cho việc tổng hợp cDNA.
Random hexanucleotide: Loại primer này thường được sử dụng khi mRNA đích có kích thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai. Khi đó việc tổng hợp cDNA không thể được thực hiện một cách hiệu quả bằng cách sử dụng mồi oligo dT hay mồi oligonucleotide antisense (Lee và Caskey, 1990, dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 13).
Trong đa số các trường hợp sử dụng kỹ thuật RT-PCR những primer oligonucleotide antisense được thiết kế để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của mRNA đích là những primer được ưu tiên chọn lựa. Primer oligo dT là lựa chọn tốt nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn cuối cùng vì random hexamer thường không đặc hiệu và tạo ra cDNA có kích thước không đồng đều, chúng thường được sử dụng khi các primer trước sử dụng không thành công.
Ly trích/tách chiết RNA AA(A)n Tổng hợp cDNA Primer đặc hiệu Primer oligo dT Random hexamer primer AA(A)n AA(A)n GSP AA(A)n Oligo dT N6 N6
AA(A)n AA(A)n AA(A)n
Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR
AA(A)n AA(A)n AA(A)n
Primer xuôi Primer xuôi Primer xuôi
AA(A)n AA(A)n AA(A)n
Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR
Primer ngược Primer xuôi
Tiếp tục chu kỳ nhiệt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp kéo dài từ ngày 01/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng quy trình RT-PCR phát hiện virus PRRS từ ba nguồn Taq khác nhau. Xây dựng quy trình điện di để phát hiện RNA tổng số.
Ly trích RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh của heo nghi nhiễm PRRSV bằng cách sử dụng hai phương pháp ly trích theo bộ kit và sử dụng TRIzol.
Chẩn đoán virus PRRS từ mẫu thu nhận bằng quy trình RT-PCR đã thiết lập.
3.3. Vật liệu và hoá chất 3.3.1. Mẫu xét nghiệm
Mẫu RNA chuẩn được cung cấp từ Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan (Pháp).
Mẫu nuôi cấy tế bào (trước đó đã kiểm tra cho kết quả ELISA dương tính) được cung cấp từ Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh: 10 mẫu
Mẫu huyết thanh và mẫu phổi được thu nhận từ các trại heo: 71 lượt mẫu. Trong đó mẫu huyết thanh là 41 mẫu, mẫu phổi là 6 mẫu.
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR
Cặp primer theo tác giả Rovira được thiết kế dựa vào trình tự của vùng đọc mở số 7 (ORF7) của virus PRRS giống Olot/91 (Rovira và cộng sự) và được cung cấp bởi công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp.
Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau:
Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng
Tên Trình tự nucleotide (5’ đến 3’) Vị trí trên genome
P1 CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 14647 đến 14667 (Lelystad) 2948 đến 2968 (VR2332) P2 GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 14938 đến 14918 (Lelystad)
3248 đến 3228 (VR2332) Rovira 1 CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA Độ dài đoạn gene nhân lên:
400bp Rovira 2 GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA
a. Bộ kit chiết tách RNA của công ty QIAGEN: QIAamp® Viral RNA Mini Kit b. Vật liệu và hóa chất trong phương pháp Sử dụng TRIzol
- Chất phản ứng TRIzol (Tripure Isolation Reagent, Boehringer Mannheim) - Chloroform
- Glycerol - Isopropanol - Ethanol 75 %
- Nước cất hai lần khử ion và khử RNase bằng cách xử lý với DEPC (diethyl pyrocarbonate)
3.3.4. Vật liệu và hóa chất điện di RNA
- Gel biến tính
- Dung dịch biến tính và đặt mẫu
- Dung dịch MOPS dùng cho điện di RNA
3.3.5. Vật liệu và hóa chất sử dụng cho RT-PCR
- Nước không có RNase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- TaqBeat™ Hot Start Polymerase wax beads (Promega)
- Taq polymerase (Biorad)
- Taq DNA Polymerase (ABgene)
- dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Promega ) - Cặp mồi
- RNA thu được từ mẫu ly trích
- AMV reverse transcriptase (Promega) - MgCl2 (Promega)
- Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega) - Reverse transcription 10X buffer (Promega)
3.3.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT - PCR
- Agarose (Biorad)
- TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, Nước cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng)
- Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE) - Ladder 100bp
- Ethidium bromide
3.4. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng
- Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C) - Tủ -700C ( Sanyo Ultra Low)
- Tủ - 200C ( CFC Free Sanyo Brandt) - Tủ mát 40C
- Máy vi sóng (Electrolux) - Máy chụp gel (Biorad) - Máy PCR (BioRad) - Máy vortex
- Bộ nguồn và bồn điện di
- Micropipet, đầu tip và eppendorf
3.5. Các phƣơng pháp
3.5.1. Bảo quản mẫu dịch nuôi cấy tế bào
Quá trình nuôi cấy tế bào giúp gia tăng số lượng virus nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ly trích và thu nhận RNA. Dịch nuôi cấy tế bào được thu nhận từ Trung Tâm Thú Y Vùng sau khi rã đông nhiều lần để giải phóng virus ra khỏi tế bào nuôi cấy. Dịch nuôi cấy được giữ ở -700C cho đến khi tiến hành quá trình ly trích.
3.5.2. Chuẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu được thu nhận từ những heo có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm virus PRRS (sẩy thai, heo con sinh ra chết). Sau đó, mẫu máu được để đông tự nhiên và thu lấy phần huyết thanh bên trên. Phần huyết thanh được trữ đông ở -700C cho đến khi ly trích.
3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus từ huyết thanh và từ dịch nuôi cấy tế bào theo TRIzol
Bước 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào
- Cho 100 l huyết thanh/dịch nuôi cấy tế bào vào ống eppendorf, sau đó cho thêm 1 ml chất phản ứng TRIzol vào ống.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA
- Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để ổn định trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở 40C để phân tách thành các phần khác nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 3: Kết tủa RNA
- Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào một eppendorf mới. Thêm 0.5ml isopropanol và 1µl glycerol vào eppendorf có chứa dịch thu được.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Loại bỏ phần dịch nổi và thu lấy phần tủa có chứa RNA.
Bước 4: Rửa RNA
- Cho 500μl ethanol 75 % vào phần tủa, tiến hành đảo nhẹ và đều khắp ống. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C.
- Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối RNA trong không khí trong 5 đến 10 phút sao cho bốc hơi hết ethanol .
Bước 5: Hòa tan RNA
- Hoà tan khối RNA trong 10 l nước không có chứa RNase. Giữ ở -200C cho đến khi sử dụng
3.5.4. Điện di RNA trên gel biến tính
Dung dịch dùng đặt mẫu 2X
Dung dịch dùng đặt mẫu là một dung dịch có màu xanh với các thành phần bromophenol blue 0,1 %, EDTA 1,6mM, formaldehyde 0,36M, glycerol 8 %, formamide 12,04 %, FA (formaldehyde agarose) gel buffer 1,6M. Dung dịch này có thể giữ trong 3 tháng ở điều kiện 20C - 80C.
Dung dịch điện di
Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch MOPS 1M, bao gồm FA gel buffer 1X, formaldehyde 2,5M, nước không có RNase, pH = 7.
Chuẩn bị gel biến tính cho quá trình điện di
Cân 0,3 g agarose, cho thêm 16 ml nước cất hai lần khử ion đã được xử lý với DEPC, đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường trong khoảng 2,5 phút). Để nguội khoảng 600C, tiếp tục cho vào 4ml FA gel buffer và 360μl formaldehyde 37 – 40 %, lắc đều. Sau đó tiến hành đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc trong khoảng 45 phút, rút lược ra khỏi gel và cho vào dung dịch điện di sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di
Cho 5 l dịch mẫu thu nhận được sau quá trình ly trích vào 5 l dung dịch buffer biến tính 2X. Ủ hỗn hợp trên trong 5 phút ở 650C
Cho nhanh hỗn hợp dung dịch trên vào nước đá trong khoảng 1 phút.
Cho 0,5 l ethidium bromide 10 mg/ml vào hỗn hợp trên và để ổn định trong khoảng 1 phút.
Đặt mẫu vào gel biến tính đã được cho sẵn vào dung dịch điện di trong 15 phút.
Tiến hành quá trình điện di với hiệu điện thế 30 volt cho đến khi buffer đặt mẫu di chuyển khoảng 3/4 gel.
Quan sát kết quả điện di dưới tia UV nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad.
3.5.5. Kỹ thuật RT-PCR trên RNA của virus
Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Trong phản ứng này, đầu tiên mồi Rovira 2 sẽ tiến hành phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ vào enzyme AMV reverse transcriptase, sau đó tiến hành sự khuếch đại đoạn cDNA vừa được tạo ra. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng được trình bày sau đây.
Thành phần phản ứng RT-PCR:
Thành Phần DDung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối
TaqBeat® Hot Start MgCl2
dNTPs
RNAsin® inhibitor
AMV reverse transcriptase Reverse transcriptase buffer Primer Rovira 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Primer Rovira 2
Nước không chứa RNase RNA mẫu 1,25 U/viên 25 mM 10 mM 20 U/µl 50 U/µl 10 X 5 µM 5 µM 1 viên 2,5 µl 0,75 µl 0,5 µl 0,25 µl 2,5 µl 0.2 µl 0,2 µl 13,1 µl 5.0 µl 1,25 U/viên 2,5 mM 0,3 mM 10 U 12,5 U 1 X 0.04 µM (1 pmol) 0.04 µM (1 pmol) Tổng thể tích 25 µl
Ngoài ra, chúng tôi còn thay thế TaqBeat® Hot Start bằng Taq DNA
polymerase của công ty Biorad và Taq DNA polymerase của công ty ABgene để chạy cùng một quy trình nhiệt.
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR
Bảng 3.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR
Bƣớc Hoạt động Nhiệt độ Thời gian
1 Phiên mã ngược 480C 30 phút
2 Tiền biến tính 950C 10 phút
3 Biến tính 950C 15 giây
4 Bắt cặp và kéo dài 600C 2 phút
5 lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ
6 Hoàn thành 720C 7 phút
7 Giữ sản phẩm 40C
Sau khi thiết kế thành công quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn, chúng tôi đã sử dụng quy trình trên để phát hiện sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu