3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR
1. Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch).
3. Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX.
4. Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần.
5. Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C.
6. Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc.
7. Thêm 500µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40
C.
8. Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 9. Thêm 50µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX.
10.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. 11.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở 40C
3.4.3.2. Lƣợng DNA thích hợp cho phản ứng đọc trình tự
Sản phẩm DNA PCR có thể định lƣợng bằng cách đo OD ở bƣớc sóng 260nm hoặc bằng phƣơng pháp khác nhƣ chạy với Mass.
Lƣợng DNA sử dụng cho phản ứng đọc trình tự thay đổi theo kích thƣớc sản phẩm DNA sau khi chạy PCR.
Mẫu Lƣợng DNA cần tƣơng ứng
Sản phẩm PCR 100-200 bp 1-3 ng 200-500 bp 3-10 ng 500-1000 bp 5-20 ng 1000-2000 bp 10-40 ng >2000 bp 20-50 ng Mạch đơn 25-50 ng Mạch đôi 150-300 ng Cosmid, BAC 0.5-1 µg Genome DNA của vi khuẩn 2-3 µg
Lƣợng sản phẩm PCR sử dụng cho đọc trình tự cũng dựa vào sự tinh sạch của sản phẩm PCR.
3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự
Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X
Thành phần Nồng độ Thể tích
Ready reaction premix 2,5 X 4µl BigDye Sequencing Buffer 5 X 2µl Primer 3.2 pmol 1µl Temlate 10-40 ng 1µl
Nƣớc cho đến 10 µl
3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự
1.Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đến thể tích chính xác 2. Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút
3. Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây 500C trong 5 giây 600C trong 4 phút 4. Giữ ở 40C
3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch bằng phƣơng pháp Ethanol/ EDTA precipitation.
Cho 5µl EDTA vào mỗi eppendorf. Chú ý phải cho vào giữa eppendorf. Thêm vào 60µl ethanol 100% vào mỗi eppendorf.
Trộn lên xuống cẩn thận khoảng 4 lần. Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.
Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 30 phút.
Lƣu ý: các bƣớc phải thực hiện liên tục. Nếu không thực hiện liên tục thì phải cộng thêm 2 phút trƣớc khi thực hiện bƣớc tiếp theo.
Lấy eppendorf ra khỏi máy ly tâm và loại bỏ phần dung dịch bên trên. Thêm vào 60µl ethanol 70%
Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thu lấy DNA, dùng giấy bạc bịt kín eppendorf lại để bảo quản tốt hơn Làm khô DNA
Cho vào DNA đã làm khô 2µl hidi
Tiến hành biến tính DNA ở 950C trong 5 phút. Sau đó load mẫu vào máy đọc trình tự và tiến hành cài đặt chƣơng trình máy để bắt đầu đọc trình tự.
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại cây trồng. cây trồng.
Qua quá trình thu thập mẫu bệnh ở một số tỉnh thành, chúng tôi đã phân lập đƣợc 12 nguồn nấm ký sinh trên nhiều loại sâu hại ở nhiều loại cây trồng khác nhau. Các nguồn nấm có ký hiệu nhƣ sau: RBCQ92, RBCQ915, BDQ96, BDTV1, BDTN4, BXĐLA3, BXĐTV7, SCLLLA1, RNBT1.5, BXĐLA8, BDLA8, BXĐTG1. Tên nguồn nấm đƣợc ký hiệu theo công thức: ký chủ + nơi thu thập + số đơn bào tử (nếu có).
Bảng 4.1: Nguồn nấm Metarrhizium anisopliae đƣợc thu thập ở một số địa phƣơng dùng trong thí nghiệm
Ký chủ Tên la tinh Cây trồng Địa điểm thu thập
Rầy bông cúc Icerya aegyptiaca Dg. Sầu riêng Quận 9 TP HCM Rầy bông cúc Icerya aegyptiaca Dg. Sầu riêng Quận 2 TP HCM Bọ dừa Brontispa longissima Dừa Quận 9 TP HCM Bọ dừa Brontispa longissima Dừa Trà Vinh
Bọ dừa Brontispa longissima Dừa Long An Bọ dừa Brontispa longissima Dừa Tây Ninh Bọ xít đen Scotinophara coartata Fab. Lúa Long An Bọ xít đen Scotinophara coartata Fab. Lúa Trà Vinh
Bọ xít đen Scotinophara coartata Fab. Lúa Tiền Giang Sâu cuốn lá lúa Parnara guttata B&G. Lúa Long An Rầy nâu Nilaparvata lugens Stal. Lúa Bến Tre
Từ các nguồn nấm thu thập đƣợc chúng tôi tiến hành tách đơn bào tử để tạo dòng thuần, nuôi cấy sợi nấm trong môi trƣờng lỏng CZA.
Hình 4.1: Nấm
Metarrhizium anisopliae
ký sinh trên rầy nâu
Hình 4.2: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ dừa
Hình 4.3: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên sâu cuốn lá lúa
Hình 4.4: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ xít đen
Hình 4.5: Sự nảy mầm của bào tử nấm dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần
Hình 4.6: Khuẩn lạc nấm Metarrhizium anisopliae sau khi tách đơn bào tử
4.2. Sử dụng phƣơng pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1). nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1).
4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae.
Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng PCR thành công hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lƣợng DNA có trong mẫu. Các thao tác phải nhẹ nhàng để tránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết cao để phản ứng PCR có thể xảy ra.
Với mục đích sử dụng qui trình tách chiết đơn giản mà vẫn đảm bảo đƣợc lƣợng DNA có thể khuếch đại đƣợc đoạn gen Pr1 mong muốn, chúng tôi thực hiện tách chiết DNA nhƣ phƣơng pháp nhƣ trên.
Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu đƣợc lƣợng DNA của các mẫu nhƣ sau:
Hình 4.7: Kết quả ly trích DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae
Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng xảy ra tốt hoặc biết đƣợc nguyên nhân nếu phản ứng PCR không xảy ra, chúng tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó chúng tôi tiến hành loại bỏ tạp nhiễm bằng RNAse. Kết quả tinh sạch đem lại kết quả rất tốt, đã loại bỏ đƣợc tạp nhiễm.
DNA thu đƣợc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần tạp nhiễm
Hình 4.8: DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae sau khi đƣợc xử lý với RNAse
Kết quả cho thấy hầu hết các mẫu ly trích đều tốt. Nhƣng do thao tác còn kém nên sản phẩm DNA ly trích bị gãy và còn nhiều tạp nhiễm. Do đó, giai đoạn tinh sạch bằng RNAse rất cần thiết. Kết quả tinh sạch bằng RNAse rất khả quan, các mẫu DNA hầu nhƣ không còn tạp nhiễm. Tuy giai đoạn tinh sạch bằng RNAse sẽ làm gãy một lƣợng nhỏ DNA nhƣng không gây ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng DNA mà còn giúp cho giai đoạn chạy PCR đƣợc dễ dàng hơn.
4.2.2. Kết quả phản ứng PCR
Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng PCR. Phản ứng PCR xảy ra tốt trong điều kiện DNA ly trích phải đúng, phải đảm bảo DNA có nồng độ và độ tinh sạch nhất định. Đối với nấm Metarrhizium anisopliae
trong nghiên cứu này thì nồng độ DNA thích hợp là 125ng. Nồng độ DNA cao hay thấp phụ thuộc vào việc pha loãng DNA trong dung dịch đệm (TE 1X) hay nƣớc vô trùng.
Phản ứng PCR thích hợp cho sự khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae với cặp mồi METPR1/METPR4 có điều kiện nhƣ sau:
Thành phần Nồng độ đầu Thể tích hút Nồng độ cuối Dung dịch đệm 10X 2.5 l 1X DNA thu đƣợc Phần tạp nhiễm
dNTP 10mM 0.5 l 200 M mỗi dNTP MgCl2 50mM 1 l 2mM
Primer 1 1.2 g/ l 2 l 114ng Primer 2 1.3 g/ l 2 l 114ng
Taq polymerase 5UI/ l 0.5 l 2.5UI DNA khuôn 125ng 1 l 125ng
Nƣớc 15.5 l
Tổng thể tích là 25 l
Quy trình nhiệt : Tách đoạn DNA: 940C 4 phút Số chu kỳ lặp lại: 37 chu kỳ
-Tách đoạn DNA 940C 1 phút -Ủ bắt cặp 530C 1 phút -Kéo dài 720C 2 phút Kéo dài 760C 6 phút
Sau khi hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc xác định sự hiện diện của gen gây độc Pr1, chúng tôi tiến hành phân tích những dòng nấm
Metarrhizium thu thập đƣợc và các dòng nấm khác nhƣ Beauveria bassiana, Rhizoctonia, Corynespora làm đối chứng để xác định tần số xuất hiện tƣơng đối của gen Pr1.
Sản phẩm PCR thu đƣợc là một đoạn DNA dài khoảng 1.5kb. Trong 12 nguồn nấm phân lập đƣợc thì chỉ có 5 nguồn nấm có xuất hiện đoạn băng có kích thƣớc 1.5kb sau khi điện di. Đó là các nguồn: BXĐTG1, BXĐTV7, BXĐLA3, RBCQ915, RBCQ2. Cũng cùng điều kiện PCR nhƣ thế, các nguồn nấm khác là Beauveria bassiana (là nấm ký sinh côn trùng gây hại), Rhizoctonia (gây bệnh trên lúa),
Corynespora (gây bệnh rụng lá trên cao su) không xuất hiện băng 1.5kb. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Leal S.C.M. (1997) đã nghiên cứu trên 40 dòng nấm Metarrhizium ở Mỹ. Kết quả, chỉ có những nguồn nấm có xuất hiện band 1.5kb là có gen gây độc Pr1.
Hình 4.9: Kết quả phát hiện gen Pr1 của các dòng nấm qua PCR
1: BXĐTV7, 2: Beauveria bassiana, 3: BXĐLA3, 4: Rhizoctonia, 5:
Corynespora, 6: RBCQ915, 7: BXĐTG1, 8: RBCQ2.
Có nhiều lý do giải thích cho việc những dòng nấm Metarrhizium còn lại không xuất hiện gen Pr1. Thứ nhất , bản thân dòng nấm Metarrhzium đó chứa gen Pr1 có sự sai khác đáng kể trong vùng primer liên kết trên gen, do đó dẫn đến primer không thể bắt cặp đƣợc và không khuếch đại tạo sản phẩm . Trong trƣờng hợp này, cũng có thể do những dòng nấm khi nuôi cấy đơn bào tử không đƣợc thuần, có sự tạp nhiễm giữa các dòng nấm Metarrhizium khác nhau mà mỗi dòng có thể có gen Pr1 khác nhau. Thứ ba là những dòng nấm Metarrhizium đã bị tạp nhiễm những dòng nấm khác trong phòng thí nghiệm khi phân lập và tách đơn bào tử. Một khả năng nữa không thể thiếu là chính những dòng nấm Metarrhizium đó có độc tính yếu hoặc không có sự hiện diện của gen Pr1 do bị mất đi một đoạn chromosome (Wang C., Skrobek A. and Butt T.M., 2003).
Kết quả PCR đã đƣa ra một tần số không cao về sự hiện diện của gen Pr1 ở
Metarrhizium (5/12). Trong đó, bọ xít đen là ký chủ có khả năng đƣợc phát hiện gen gây độc Pr1 nhiều nhất với cặp mồi METPR1/METPR4. Do số lƣợng mẫu còn hạn chế nên chƣa đánh giá một cách tổng quát sự hiện diện của Pr1 cũng nhƣ sự phân bố của nấm Metarrhizium trong tự nhiên. Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu với số lƣợng mẫu lớn hơn nếu có điều kiện.
2 kb 1.5 kb 1 kb
4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr1 của nấm
Metarrhizium.
Để xác định chính xác đoạn gen khuếch đại đƣợc từ PCR là gen gây độc Pr1, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này bằng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Bƣớc đọc trình tự này cũng nhằm khẳng định mức độ tin cậy của quy trình PCR khuếch đại gen Pr1 và xác định sự sai khác giữa các dòng nấm
Metarrhizium trong nƣớc với nhau cũng nhƣ giữa dòng nấm Metarrhizium trong nƣớc và thế giới. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm PCR với cặp mồi METPR1/METPR4 đƣợc tinh sạch bằng kit: GFX PCR DNA and GelBand Purification kit (Amersham Biosciences) và đọc trình tự bằng cặp mồi METPR5/METPR2 – là cặp mồi đƣợc thiết kế nằm bên trong cặp mồi METPR1/METPR4.
Còn nhiều hạn chế về thời gian thực hiện đề tài cũng nhƣ hóa chất, chúng tôi chỉ tiến hành giải trình tự hai mẫu BXĐTG1 và BXĐTV7. Kích thƣớc đoạn gen Pr1 khá dài nên việc đọc trình tự gặp nhiều khó khăn. Kết quả trình tự đọc đƣợc không đảm bảo độ chính xác 100%. Những đoạn trình tự lúc primer bắt đầu đọc và lúc primer sắp kết thúc quá trình đọc thì có những tín hiệu rất xấu, không rõ ràng. Chúng tôi sẽ lấy một đoạn trình tự đáng tin cây nhất sau khi đọc bằng hai mồi xuôi và ngƣợc để phân tích trong những bƣớc tiếp theo. Một đoạn trình tự của gen Pr1 dài khoảng 1038 bp của mẫu BXĐTG1và BXĐTV7 nhƣ sau:
1 GGATGATATTGCCCGGATCGCTACCGATGACAAGGTCATCGCTCTTACCTCCAAAGCGCG 60 61 ACTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGA 120 121 AGATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTTCCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGG 180 181 AGACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGAC 240 241 GCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGC 300 301 ATCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGT 360 361 ACTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCC 420 421 AAAACTCCATAGGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCG 480 481 CCACTTTTCTTAGGAGCTTCATCAGCGGTCAAGAAACTGATGGCCACGGCCATGGGACTC 540 541 ACTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATG 600
601 GTGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGG 660 661 ACTACGTTGCCAGTGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAAAGGCGCCATTGCTTCCATGA 720 721 GCCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTGAATTCTG 780 781 GTGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCG 840 841 CTTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAGTGACAGACGATCTTCCT 900 901 TCTCCAACTTCGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCT 960 961 GGATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACAGCCTTT 1020 1021 TGCTTCAGAACCAGCTCT 1038
Trình tự của các nguồn nấm trên genbank đƣợc sử dụng trong các phân tích tiếp theo có thông tin cụ thể đƣợc nêu ở bảng 4.2.
Bảng 4.2: Các nguồn nấm Metarrhizum trên genbank đƣợc dùng để so sánh.
Accession
number Tác giả Nguồn nấm Ký chủ
AY389128 Wang C. M. anisopliae var anisopliae Rầy nâu AY389135 Wang C. M. anisopliae var anisopliae Chƣa biết AY389134 Wang C. M. anisopliae var anisopliae Rầy nâu
AY389130 Wang C. M. anisopliae var acridum Schistocerca picefrons
(Acrididae)
AY389131 Wang C. M. anisopliae var acridum Schistocerca picefrons
(Acrididae) AJ416695 Bagga S. M. anisopliae var anisopliae Con tằm
Trình tự các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae sau khi tiến hành so sánh bằng phần mềm Clustal W có kết quả nhƣ bảng 4.3
Bảng 4.3: So sánh trình tự nucleotid đoạn gen Pr1 của hai mẫu BXĐTG1, BXĐTV7 với các trình tự trên genbank.
AJ416695 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATACGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA AY389134 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATACGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA MAU8.1 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACAAGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA MAU5.1 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACAAGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA AY389128 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACAAGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA AY389135 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACAAGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA AY389131 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACACGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA AY389130 GGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACACGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGA ****************************** * *** *********************** AJ416695 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA AY389134 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA MAU8.1 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA MAU5.1 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA AY389128 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA AY389135 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA AY389131 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCCCACCAAGGAGGAGCTGAA AY389130 CTTCGTTTACGAGCACGCCTTCCATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAA ***************************************** ****************** AJ416695 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA AY389134 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA MAU8.1 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTTCCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA MAU5.1 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTTCCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA AY389128 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA AY389135 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGA AY389131 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGA AY389130 GATGCTTCGTGAGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGA **************************** *************************** *** AJ416695 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG AY389134 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG MAU8.1 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG MAU5.1 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG AY389128 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG AY389135 GACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG AY389131 GACATGTAGGTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG AY389130 GACATGTAGGTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTGAGAAGGACG ********* ******** ************ **************************** AJ416695 CTGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA AY389134 CTGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA MAU8.1 CTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA MAU5.1 CTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA AY389128 CTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA AY389135 CTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA
AY389131 CCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA AY389130 CCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCTCCCTGGGGTCTTGGGCGCA * ****************** *************************************** AJ416695 TCTCTCACCGCAGTAAGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTCAGGGTA AY389134 TCTCTCACCGCAGTAAGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTCAGGGTA MAU8.1 TCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTA MAU5.1 TCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTA AY389128 TCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTA AY389135 TCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAAGGTA AY389131 TCTCACACCGCCAGAAGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCCGGTGAGGGTA AY389130 TCTCACACCGCCAGAAGGGAAGCACCACCTATCGCTACGATGATAGTGCCGGTGAGGGTA **** ****** * ********************************* *** * **** AJ416695 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCA AY389134 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCA MAU8.1 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCA MAU5.1 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCA AY389128 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCA AY389135 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCA AY389131 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCA AY389130 CTTGCGTATATATCATTGACACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCA ********************************************************* ** AJ416695 AAACTCCATAGTGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389134 AAACTCCATAGTGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC MAU8.1 AAACTCCATAGGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC MAU5.1 AAACTCCATAGGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389128 AAACTCCATAGGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389135 AAACTCCATAGGGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389131 AAACTCCATAGCGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389130 AAACTCCATAGCGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTGGAGGGTCGTGC *********** * ********************************** ******** ** AJ416695 CACTTTTCTTAAGAGCTTCATCAGCGGTCAAAACACTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA AY389134 CACTTTTCTTAAGAGCTTCATCAGCGGTCAAAACACTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA MAU8.1 CACTTTTCTTAGGAGCTTCATCAGCGGTCAAGAAACTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA MAU5.1 CACTTTTCTTAGGAGCTTCATCAGCGGTCAAGAAACTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA AY389128 CACTTTTCTTAGGAGCTTCATCAGCGGTCAAGAAACTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA AY389135 CACTTTTCTTAGGAGCTTCATCAGCGGTCAAGAAACTGATGGGCACGGCCATGGGACTCA AY389131 CACTTTTCTTAAGAGCTTCATCAGCGGTCAAACCTCTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA AY389130 CACTTTTCTAAAGAGCTTCATCAGCGGTCAAACCTCTGATGGCCACGGCCATGGGACTCA ********* * ******************* ******* ***************** AJ416695 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAGACCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG AY389134 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAGACCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG MAU8.1 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG MAU5.1 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG AY389128 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG AY389135 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCCAAAAGGCTAAGCTCTATGG AY389131 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGTGTTGCCAAAAAGGCTAAGCTCTATGG AY389130 CTGCGCTGGTACCATTGGTAGCAAAAGCTACGGCGTTGCCAAAAAGGTTAAGCTCTATGG ************************ * ****** ****** ****** ************ AJ416695 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA AY389134 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA MAU8.1 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA MAU5.1 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA AY389128 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA AY389135 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA AY389131 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA AY389130 TGTCAAGGTTCTTGACAACCAGGGCAGTGGTTCCTACTCCGGTATCATCAGTGGCATGGA ************************************************************
AJ416695 CTACGTTGCACAGGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAACGGCGCCATTGCTTCCATGAG AY389134 CTACGTTGCACAGGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAACGGCGCCATTGCTTCCATGAG MAU8.1 CTACGTTGCCAGTGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG MAU5.1 CTACGTTGCCAGTGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG AY389128 CTACGTTGCCAGTGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG AY389135 CTACGTTGCCAGTGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCCAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG AY389131 CTACGTTGCACAGGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCTAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG AY389130 CTACGTTGCACAGGACTCCAAGACCCGCGGCTGCCCTAAAGGCGCCATTGCTTCCATGAG ********* *********************** ** ******************** AJ416695 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTCAATTCTGG AY389134 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTCAATTCTGG MAU8.1 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTGAATTCTGG MAU5.1 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTGAATTCTGG AY389128 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTGAATTCTGG AY389135 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTGAATTCTGG AY389131 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTCAATTCTGG AY389130 CCTGGGAGGTGGCTACTCGGCGTCCGTCAACCAAGGTGCTGCTGCTTTGGTCAATTCTGG *************************************************** ******** AJ416695 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC AY389134 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC MAU8.1 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC MAU5.1 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC AY389128 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC AY389135 TGTCTTCCTCGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC AY389131 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC AY389130 TGTCTTCCTTGCCGTCGCCGCTGGCAACGATAACCGGGATGCCCAGAACACCTCTCCCGC ********* ************************************************** J416695 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCTCTGCGGAAAATGACAGCCGATCTTCCTT AY389134 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCTCTGCGGAAAATGACAGCCGATCTTCCTT MAU8.1 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAGTGACAGACGATCTTCCTT MAU5.1 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAGTGACAGACGATCTTCCTT AY389128 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAGTGACAGACGATCTTCCTT AY389135 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAGTGACAGACGATCTTCCTT AY389131 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAATGACAACCGATCTTCCTT AY389130 TTCCGAGCCTTCTGCCTGCACTGTTGGTGCCACTGATTCAAATGACAACCGATCTTCCTT ******************************* *** ** ***** *********** AJ416695 CTCCAACTACGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTAGCAATGTTCTTTCCACCTG AY389134 CTCCAACTACGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTAGCAATGTTCTTTCCACCTG MAU8.1 CTCCAACTTCGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG MAU5.1 CTCCAACTTCGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG AY389128 CTCCAACTTCGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG AY389135 CTCCAACTTCGGCAGAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG AY389131 CTCCAACTACGGCAAAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG AY389130 CTCCAACTACGGCAAAGTTGTCGATATTTTCGCTCCTGGTACCGGTGTTCTTTCCACCTG ******** ***** ************************** * *************** AJ416695 G-ATTGGTGGCCGCACAGTAAGTATTGTACCT----CGATAAGCTCGGAGACACGCTTTT AY389134 G-ATTGGTGGCCGCACAGTAAGTATTGTACCT----CGATAAGCTCGGAGACACGCTTTT MAU8.1 GGATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACAGGCTTTT MAU5.1 GGATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACAGGCTTTT AY389128 G-ATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACAGGCTTTT AY389135 G-ATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACAGGCTTTT AY389131 G-ATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGATACGCTTTT AY389130 G-ATTGGTGGCAGCACTGTAAGTATTGTACCTACCTCGATAAGCTTAGAGACACGCTTTT * ********* **** *************** ********* **** * ******
AJ416695 GCTTCAGCACCAGCTCT AY389134 GCTTCAGCACCAGCTCT MAU8.1 GCTTCAGAACCAGCTCT MAU5.1 GCTTCAGAACCAGCTCT AY389128 GCTTCAGAACCAGCTCT AY389135 GCTTCAGAACCAGCTCT AY389131 GCTTCAGCACCAGCTC- AY389130 GCTTCAGCACCAGCTC- ******* ********
Chú thích: MAU8.1 là mẫu BXĐTG1, MAU5.1 là mẫu BXĐTV7. Kết quả so sánh cho thấy:
- Hai nguồn nấm BXĐTG1 và BXĐTV7 không có sự khác nhau về trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 thu đƣợc. Hai nguồn nấm này đƣợc phân lập trên cùng một ký chủ là bọ xít đen chỉ có nơi phân lập là khác nhau. Tiền Giang và Trà Vinh là hai vùng không có sự khác nhau đáng kể về mặt điều kiện tự nhiên. Do đó, trong trƣờng hợp này vị trí địa lí không thể hiện sự ảnh hƣởng đối với sự đa dạng của gen
Pr1. Nếu có điều kiện chúng tôi sẽ giải trình tự trên nhiều ký chủ cũng nhƣ vùng phân lập khác nhau để có kết quả chính xác hơn.
- Trình tự gen Pr1 của hai nguồn nấm BXĐTG1 và BXĐTV7 có độ tƣơng đồng khá cao với các công bố trên genbank (thấp nhất là 96% đối với hai mẫu