3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
4.4.2Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt
Tiến hành thực hiện phản ứng trung hòa độc tố trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Vero đối với mẫu huyết thanh của lô 5 có bổ sung sodium azid và bất hoạt ở 56oC
trong thời gian 30 phút. Kết quả nhƣ sau:
Hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm 24h và 48h
Thời điểm 24 giờ:
Đối chứng tế bào phát triển tốt, môi trƣờng vẫn có
Đối chứng độc tố: có hiện tƣợng tế bào chết với hình thái nhƣ chết do độc tố: tế bào co tròn, chuyển màu sậm hơn so với thảm tế bào bên dƣới nhƣng chƣa rõ ràng.
Ở các giếng mẫu: có hiện tƣợng tế bào chết hàng loạt nhƣng lớp tế bào dƣới đáy giếng vẫn còn. Môi trƣờng vẫn còn màu hồng chứng tỏ tế bào vẫn phát triển tốt không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn.
32
Thời điểm 48 giờ:
Đối chứng dƣơng: tế bào vẫn phát triển bình thƣờng, màu môi trƣờng không đổi chứng tỏ không có hiện tƣợng nhiễm khuẩn.
Đối chứng âm: Tế bào chết hàng loạt sau 48giờ nuôi cấy.
Đối với mẫu: Các tế bào này khi chết co cụm, bám thành mảng và sậm màu, thảm tế bào ở dƣới chết hoàn toàn. Ở nồng độ pha loãng huyết thanh càng thấp thì số tế bào chết càng ít. Điều này khác với chết do độc tố. Tế bào chết do độc tố cũng co lại nhƣng riêng rẻ, có màu nhạt, bên dƣới vẫn còn thấy lớp tế bào mỏng, và nếu nhƣ huyết thanh không có kháng thể để trung hòa độc tố thì tế bào ở các giếng này phải chết tƣơng đƣơng nhau. Ngƣợc lại, nếu huyết thanh có kháng thể thì lƣợng tế bào chết là tỉ lệ nghịch với độ pha loãng. Hơn nữa, đối chứng tế bào vẫn phát triển tốt, môi trƣờng không đổi màu nên không có hiện tƣợng bị nhiễm khuẩn ở đây. Do đó chúng tôi kết luận tác nhân chính gây hiện tƣợng chết tế bào không phải do độc tố VT2e.
Kết quả đo OD 620nm
Từ kết quả đo OD 620nm (bảng 3) cho thấy:
Các giếng ở nồng độ huyết thanh cao (1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64) thì chỉ số OD thấp và thấp so với đối chứng âm, có nghĩa là tế bào chết nhiều so với đối chứng độc tố.
Các giếng có nồng độ huyết thanh càng thấp (1/128, 1/256, 1/512, 1/1024, 1/2048) thì chỉ số OD càng cao, nghĩa là tế bào chết càng ít.
Điều này không đúng với nguyên tắc trung hòa độc tố: nếu huyết thanh có kháng thể thì nồng độ huyết thanh càng cao khả năng trung hòa độc tố càng cao. Do đó tế bào không bị chết bởi độc tố nên chỉ số OD cao. Hay nói cách khác nồng độ huyết thanh tỉ lệ thuận với chỉ số OD. Trong trƣờng hợp nếu huyết thanh không có kháng thể chống lại độc tố hay kháng thể quá thấp thì các giếng này sẽ chết tƣơng đƣơng nhau và tƣơng đƣơng với đối chứng âm.
Chỉ số OD của giếng đối chứng âm chênh lệch với đối chứng dƣơng không rõ rệt (0.041 ở phiến 1 và 0.046 ở phiến 2) chứng tỏ độc tố trong thử nghiệm này kém hoạt tính và chỉ số OD của các giếng có nồng độ huyết thanh thấp lại cao hơn so với đối chứng dƣơng. Do đó độc tố không khả năng gây chết tế bào hàng loạt nhƣ trên. Bởi vì huyết thanh chúng tôi lấy trong điều kiện vô trùng, có bất
33
hoạt các thành phần có trong huyết thanh có khả năng gây hại cho tế bào trƣớc khi thử nghiệm nhƣ bổ thể,…nhƣng lại bổ sung sodium azid để tăng thời gian bảo quản nên có thể do sodium azid đã gây chết tế bào hàng loạt. Vì chất này là một chất kháng khuẩn nên có thể gây hại cho tế bào. Để khẳng định điều này chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm chứng minh sodium azid là yếu tố gây chết tế bào.