Các phản ứng nhận biết các acidamin đặc trưng- 123docz.net

3.2.1. Phản ứng ninhydrin

Tất cả các α-acid amin của protein đều phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất màu xanh tím(hấp thụ cực đại ở bước sóng 570nm). Phản ứng này rất nhạy có thể phát hiện đến microgram acid amin,vì vậy được dùng nhiều trong phân tích định tính và định lượng acid amin(trong phương pháp sắc kí và điện di). Cơ chế phản ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất. Có thể nêu một số phản ứng chính như sau:

Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao,acid amin tạo thành NH3, CO2 và andehit tương ứng có mạch carbon ngắn hơn acid amin 1 carbon;ninhydrin chuyển thành aminodixetohydrinden. [1]

Hình 3.4 Hình sơ đồ phản ứng ninhydrin [3]

Aminodixetohydrinden, NH3 mới tạo thành tiếp tục phản ứng với 1 phân tử ninhydrin khác tạo thành hợp chất màu xanh tím có công thức như sau:

O O O O O N O O

Đặc biệt riêng aminoacid như prolin khi tạo phức chất với ninhydrin sẽ có màu vàng, khác biệt hẳn với màu do acid amin khác tạo nên trong phản ứng. Do vậy, ninhydrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin.

3.2.2 Phản ứng Xantoprotein với acid amin vòng

Đây là những phản ứng đặc trưng cho những protein có chứa acid amin vòng như phenilalanin,tirozin, tryptophan. Khi đun nóng dung dịch protein với HNO3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất Nitơ màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có cấu tạo Quinoit màu da cam. Ngược lại, các protein không chứa acid amin vòng như gelatin không cho phản ứng này. [3]

Hình 3.6 sơ đồ phản ứng Xantoprotein với acid amin vòng

3.2.3 Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin

Thuốc thử Millon là hỗn hợp các muối Nitrat và nitric thủy ngân được hòa tan trong HNO3. Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ. [3]

Hình 3.7 sơ đồ phản ứng Millon

3.2.4 Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan

Trong môi trường acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại aldehid tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng. [1]

Hình 3.8 sơ đồ phản ứng Adamkievic

3.2.5 Phản ứng Sakagichi đặc trưng cho arginin

Đây là phản ứng phát hiện arginin: khi tác dụng với hypobromit(NaBrO) và α- naphtol,arginin sẽ tạo sản phẩm màu đỏ cam. [3]

Hình 3.9 sơ đồ phản ứng Sakagichi

3.2.6 Phản ứng của các acid amin chứa lưu hùynh (phản ứng Folia)

Các acid amin chứa lưu hùynh như cystin, cystein, methionin dưới tác dụng của kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua( Na2S) [3]:

RSH + 2 NaOH  Na2S + ROH + H2O

Thêm chì acetat và Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sulfua (PbS): Na2S + Pb(CH3COO)2  2(CH3COO)Na + PbS (kết tủa màu đen)

3.2.7. Phản ứng của prolin với thuốc thử Isatine

3.2.7. Phản ứng của prolin với thuốc thử Isatine (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ngoài phản ứng màu đặc trưng với ninhydrin, prolin còn có thể phát hiện được dễ dàng nhờ phản ứng với thuốc thử Isatine. [3]

Hình 3.10 sơ đồ phản ứng của Prolin với thuốc thử Isatine 3.2.8. Phản ứng Pauli để phát hiện histidin và tyrozin

Khi tác dụng với acid diazobenzosunfonic (thuốc thử diazo), histidin tạo thành phức chất màu da cam. [3]

Sự tạo thành aciddiazobenzosunfonic:

Phản ứng của tyrozin:

Hình 3.11 sơ đồ phản ứng Pauli

3.2.9. Phản ứng với acid nitơ (HNO

3.2.9. Phản ứng với acid nitơ (HNO22) (phương phápVan Slyke)) (phương phápVan Slyke)

Dưới tác dụng của HNO2 , acid amin bị dezamin dezamin hóa tạo thành nitow ở dạng khí. Phản ứng này được sử dụng để định lượng các -acid amin( phương pháp Van Slyke). [3]

Phản ứng xảy ra như sau:

3.2.10. Phản ứng với nitơ pruxit đặc trưng cho các acid amin, protein chứa lưu

huỳnh

Phản ứng diễn ra tương tự như phản ứng Folia, nhưng ở phản ứng này, natri nitropruxit thay thế vị trí của chì axetat. [3]

Hình 3.12: Hình sơ đồ phản ứng với nitơ pruxit đặc trưng cho các acid amin, protein chứa lưu huỳnh

3.3. Các phương pháp định lượng axit amin 3.3.1. Phương pháp hóa lý

Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng acid amin thường là sự kết hợp của nhiều phương pháp hóa lý và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp thụ các acid amin không giống nhau để phân tích. Hoặc dựa vào cấu trúc acid amin tự do sau khi chuỗi Polypeptide đã bị thủy phân, có thể định lượng acid amin đầu N - tận cùng

bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy, có thể xác định acid amin đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm Carboxyl với tác nhân khử NaBH4 hoặc sử dụng enzyme carboxypeptidase…

3.3.2. Sắc ký

Người ta có thể dung nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tich acid amin

3.3.2.1. Sắc ký giấy

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bão hòa hơi nước, giấy có thể giữ 15-20% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữa cơ bão hòa nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định được gọi là Rf.

Rf = a/b Trong đó:

• a: là khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích • b: là khoảng cách dịch chuyển của dung môi

Có nhiều sắc ký giấy khác nhau đó là sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký võng nằm ngang và sắc ký hai chiều..Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Shleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol: 1 Acetic acid: 5 nước (dùng cho chiều thứ nhất: 3 phenol: 1 nước (dùng cho chiếu thứ 2).

3.3.2.2. Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc của phương pháp này dực trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được trán rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là Silicagel, alumin acid,Sephadex,v.v… được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính.

3.3.2.3. Sắc ký khí (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn

xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydric acetic.

Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglyco 1% (cobowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 1250C và 1550C, tốc độ chảy 60-240 ml/phút.

3.3.3. Phân tích bằng máy tự động

3.3.3.1. Xác định trình tự (sequence) acid amin trong chuỗi polypeptide

Máy phân tích acid amin trong chuỗi polypeptide tự động dựa trên nguyên tắc của phương pháp Edman, Nghĩa là tách lần lượt các acid amin ở đầu N tận cùng và xác định lần lượt theo thứ tự từng acd amin được tách ra đó, vì vậy có thể xác định chính xác trình tự sắp xếp của các acid amin trong chuỗi.

3.3.3.2. Xác định thành phần acid amin trong chuỗi polypeptide bằng máy sắc ký lỏng cao áp-HPCL (Hight Liquid Pressure Chromatography)

Trước hết protein hay peptide phải được thủy phân bằng HCl 6N ở 1100C trong ống hàn kín chứa Nitrogen (để tránh sự oxy hóa phá hủy acd amin) trong thời gian 12-15 giờ. Sau đó trung hòa hỗn hợp dung dịch thủy phân acd amin và cho vào máy phân tích tự động HPLC thành phần acd amin cùng với mẫu chuẩn acid amin. Máy tự động sẽ cho biết hàm lượng ( =tỷ lệ %) của từng acid amin dưa theo các đỉnh (peak) của acid amin chuẩn. Cần nhớ máy HPLC chỉ cho biết thành phần (composition) của từng acid amin chứ không cho biết trình tự các acid amin.

3.3.4. Điện di

Dựa vào tính chất tích điện của các acid amin trong môi trường có pH nhất định , mà có thể phân tích các acid amin bằng kỹ thuật điện di. Dưới tác dụng của điện trường các acid amin tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực âm (-), các acid amin tích điện âm sẽ chạy về phía cực dương. Do khả năng tích điện không giống nhau của các acid amin vì vậy chúng di chuyển không giống nhau trong điện trường. Kết quả các acid amin phân bố trải ra trên giá thể (giấy hoặc tấm polyamide).

3.3.5. Phân tích bằng quang phổ khối

Quang phổ khối (MS-mass spectrophotometer) là một công cụ phân tích với độ chính xác cao. Nguyên tắc của phương pháp này là: dùng một chùm electron bắn vào một lượng chất thử rất nhỏ, các phân tử chất thử trước hết được phá thành nhiều mánh ion mang điện dương trong điều kiện chân không. Các mánh ion nhờ một bộ

phận phát điện vá ghi thánh pic vối cường độ khác nhau tương ứng với mỗi khối lượng của mỗi ion – đó là khối phổ.

Có nhiều loại máy quang phổ khối với mức độ phân giải khác nhau, máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mánh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối.

TÀI LIỆU THAM KHẢO