Trong việc tạo dòng và biểu hiện gen vào một đối tượng khác thì vật chủ là một yếu tố quyết định đến sự thành công cũng như hiệu suất của quá trình. Bên cạnh những ưu điểm của E. coli như vòng đời ngắn, khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh, nó cũng có nhược điểm như không có quá trình hậu dịch mã. Từ đó, việc biểu hiện các gen được phân lập từ sinh vật nhân chuẩn sẽ gặp nhiều khó khăn. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã chọn những vật chủ khác có nguồn gốc là sinh vật nhân chuẩn làm vật chủ biểu hiện như nấm men S. cerevisiae hay Pichia pastoris [43].
29
Một nghiên cứu của Rashed và cs (2010) đã biểu hiện endochitinase, cht2 của Trichoderma virens UKM1 và nấm men Pichia pastoris, gen cht2 và trình tự cDNA của nó được tạo dòng và giải trình tự, kết quả có thể gen cht2 dài 1169 bp, mã hóa cho protein dài 321 amino acid, sau đó trình tự cDNA được tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαC và biến nạp vào nấm men P. pastoris
X33 sử dụng promoter cảm ứng methanol, protein tái tổ hợp được sản xuất ra có khối lượng phân tử 35 kDa khi cảm ứng 0,5% methanol. Để phân tích xem enzyme tái tổ hợp có chức năng sinh học hay không, Rashed đã thử hoạt tính phân giải colloidal chitin của enzym này, kết quả cho thấy hoạt độ riêng của enzyme đạt 1,34 U/mg, enzyme hoạt động tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ 350
C và ổn định trong khoảng pH 5.0 đến 7.0 và nhiệt độ 30 đến 550
C [57].
Baccatin III, một chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp Taxol, là một tiền chất hữu ích để bán tổng hợp thuốc chống ung thư, được sản xuất từ những loài thủy tùng, thông qua một chuổi của 15 bước xúc tác nhờ enzyme trong quá trình trao đổi chất sơ cấp. Mười gen mã hóa cho những enzyme tham gia vào quá trình này đã được mô tả, từ đó cho phép thiết kế lại các giai đoạn sớm của quá trình trao đổi chất taxane diterpenoid (taxoid) trong vật chủ
S. cerevisiae. Tám trong số các gen taxoid này được biểu hiện chức năng trong nấm men từ các vector episome chứa 1 hoặc nhiều cassett liên kết chặt chẽ với với các đuôi epitope khác nhau cho phép giám sát và phân biệt protein của những enzyme có cùng kích thước. Cả tám loại protein tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật immunoblotting sử dụng những kháng thể đơn dòng đặc hiệu và mỗi protein biểu hiện được xác định có chức năng bằng phân tích enzyme in vitro, hoạt độ có sự khác nhau đáng kể giữa các loại enzyme. Các bước phân tích chỉ ra rằng, những tiền chất isoprenoid từ nấm men có thể được sử dụng trong con đường cấu thành lại bởi vì các sản phẩm tích lũy từ 2
30
giai đoạn đầu của quá trình thiết kế (dẫn đến việc chuyển thành taxadiene trung gian) [40].
Gen mã hóa Isoamylase (iso) của Pseudomonas amyloderamosa được khuếch đại bằng PCR và được tạo dòng vào vector S. cerevisiae dưới sự điều khiển của gen mã hóa alcohol dehydrogenase và promoter glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase. Trình tự tín hiệu của gen iso cũng được thay thế bằng gen mã hóa α-amylase Schwanniomyces occidentalis. Hoạt độ isoamylase ngoại bào của S. cerevisiae đạt đến 86 U/ml sau khi nuôi 4 ngày. Nghiên cứu này mô tả cấu trúc của plasmid chứa gen iso từ Pseudomonas amyloderamosa và sự biểu hiện chức năng của isoamylase trong S. Cerevisiae [55].
Hiện nay, có nhu cầu về việc tiêu thụ rượu chứa độ cồn và các chất bảo quản hóa học thấp. Trong nghiên cứu này, các tác giả biểu hiện gen mã hóa 1 glucose oxidase (GOX; β-D-glucose: oxygen oxidoreductase, EC 1.1.3.4) của
A. niger trong S. cerevisiae và đánh giá khả năng sản xuất rượu có nồng độ cồn thấp và sự ức chế các sinh vật làm hỏng rượu của chủng biến nạp. Gen cấu trúc GOX được tạo dòng vào vector Yip5 chứa trình tự tín hiệu MFa1S, promoter phosphoglycerate-kinase-1(PGK1P) và terminator PGK1T. Cassette PGK1P-MFa1S-gox-PGK1T có ở chủng S. cerevisiae S1278. Các kết quả phân tích cho thấy, glucose oxidase tái tổ hợp có hoạt tính và được sản suất sớm và ổn định ở pha sinh trưởng. Nấm men biến nạp cũng cho hoạt tính kháng vi sinh vật và rượu chứa lượng cồn thấp hơn 1,8–2,0% [53].
Sự dung hợp giữa gen cấu trúc a-factor trong nấm men và gen mã hóa protein tương tự ở người đã được thiết kế. Những protein lai bao gồm 89 amino acid đầu tiên của tiền chất a-factor, hoạt động dung hợp với protein ngoại lai có khối lượng nhỏ (j8-endorphin, 31 amino acids) hoặc protein lai có khối lượng lớn (a-interferon,166 amino acids). Promoter a-factor được sử dụng để điều khiển sự phiên mã gen dung hợp trong S. cerevisiae, protein
31
ngoại lai được tiết ra môi trường nuôi cấy một cách có hiệu quả. Sự phân cắt protein liên quan đến sự trưởng thành của những peptide a-factor từ tiền chất hoạt động cũng xuất hiện chính xác trong protein lai. Sự phân cắt xuất hiện ở vị trí carboxyl của 2 lysine nằm trong peptide 6-endorphin [19].
Gen mã hóa xylanase (xynA) của Aureobasidium pullulans được biểu hiện trong S. cerevisiae và sản phẩm của nó được tiết vào trong môi trường. Khung đọc mở của xynA được tạo dòng trong S. cerevisiae, bao gồm phần mã hóa peptide tín hiệu. Sản phẩm biểu hiện có hoạt độ xylanase 6,7 U/ml trong phân đoạn liên kết tế bào và 26,2 U/ml trong môi trường nuôi cấy sau 4h cảm ứng với galactose. Kết quả cho thấy rằng, peptide tín hiệu xynA hỗ trợ cho quá trình hậu dịch mã của sản phẩm xynA và xylase hoạt động từ nấm men tiết một cách hiệu quả vào môi trường nuôi cấy (gấp 3 lần so với A. pullulans) [71].
Gen mã hóa chitinase ech42 được lấy từ T. aureoviride M và được khuếch đại bằng PCR, sau đó được phân tích trình tự. Kết quả cho thấy, khung đọc mở của ech42 có kích thước 1.447 bp, mã hóa cho 421 amino acid và có 3 vùng intron được tìm thấy trong trình tự. Vector tạo dòng pMD18-T và vật chủ E. coli DH5α được sử dụng để tạo thành DH5α/ech42 . Gen ech42 được chèn vào pYES2, kết quả tạo ra vector tái tổ hợp pYES2/ech42. Chitinase biểu hiện bởi pYES2/ech42 được cảm ứng bằng galactose trong môi trường lên men lỏng, sau 36 giờ có hoạt độ cao nhất là 0,5 U/ml [63].
32
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Gen chitinase của các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ đất ở Quảng Điền, Thừa Thiên Huế và Cam Lộ, Quảng Trị