Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (dịch thể hoặc tế bào) với kháng nguyên thì phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu. Kháng thể dịch thể (các loại Ig) thường tồn tại trong huyết thanh và dịch cơ thể nên phản ứng kháng nguyên – kháng thể còn gọi là phản ứng huyết thanh học.
Phản ứng huyết thanh học là phản ứng xảy ra dựa trên cơ chế miễn dịch học, đó là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, mà cụ thể là giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể. Phân tử IgG có hai trung tâm hoạt động nên kết hợp được với hai phân tử kháng nguyên cùng loại. Các kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định sẽ kết hợp với nhiều phân tử kháng thể tương ứng.
Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể dịch thểđặc hiệu nhờ lực liên kết lý hoá và biểu hiện làm hai pha phản ứng.
• Lực liên kết
- Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Van der Waals.
- Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ: giữa nhóm amin và carboxyl (NH2 và COOH) của hai phân tử protein.
- Lực liên kết giữa các cầu nối hydro giữa các nhóm hydroxyl.
• Các pha của phản ứng
Khi thực hiện phản ứng kháng nguyên và kháng thểở in vitro, kết quả của phản ứng có thể trực tiếp hoặc gián tiếp quan sát được bằng mắt thường hoặc bằng kính hiển vi.
Với những phản ứng kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát được bằng mắt thường, phản ứng thường xảy ra theo hai pha.
Pha thứ nhất: Đặc trưng bởi sự hấp thụ kháng thể lên bề mặt kháng nguyên tương ứng, pha này xảy ra nhanh được gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Trong pha này, thực chất là sự tìm đến và kết hợp đặc hiệu giữa nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể, tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Pha thứ hai: Tiếp sau pha thứ nhất, xảy ra chậm hơn và biểu hiện ra ngoài nên có thể nhìn thấy được như ngưng kết thành mạng lưới, tạo thành hạt lổn nhổn, mịn như cát, hoặc như sợi bông, hoặc kết tủa thành cặn màu trắng lắng xuống đáy; pha này thực chất là theo nguyên lý lý hoá đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy được.
2.6.2. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two
dimensions)(Kỹ thuật Ouchterlony) [6]
Phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu của kháng thểđối với kháng nguyên là phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony).
Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử có trọng lượng lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn. Kháng nguyên và kháng thể sau khi
được phủ đầy vào các giếng sẽ khuếch tán toả tròn xung quanh các giếng và hình thành građien nồng độ. Khi nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng nhau, một
đường hoặc cung kết tủa xuất hiện. Thông thường đường kết tủa được tạo thành ở tỉ lệ
kháng thể - kháng nguyên là 4:1. Đường kết tủa được tạo thành giữa kháng nguyên và kháng thể hoạt động như một hàng rào miễn dịch đặc hiệu, ngăn chặn sự tiếp tục khuếch tán của các cặp kháng nguyên – kháng thể nhưng không cản trở sự khuếch tán của từng phân tử kháng nguyên, kháng thể.
Khi nhận định kết quả, căn cứ vào đường kết tủa, có thể có 3 trường hợp xảy ra: - Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhất (Hình 2.8A).
- Nếu hai giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau, tức hai kháng nguyên không có liên quan với nhau. Đây là hiện tượng hai kháng nguyên không đồng nhất nhau (Hình 2.8B).
- Nếu hai giếng chứa kháng nguyên có liên quan một phần với kháng thể
(cùng có chung một nhóm quyết định A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn (Hình 2.8C).
2.7. PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ ĐỘC TỐ VT2e TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO VERO VERO
2.7.1. Sơ lược về tế bào vero[5]
Dòng tế bào vero (Vervet Monkey Origin) được Y. Yasumura và Y. Kawakita ở đại học Chiba, Nhật Bản thiết lập vào năm 1962, khởi đầu từ nuôi cấy tế bào thận khỉ
xanh Châu Phi (Cercopithecus aethiops). Sau một số lần cấy truyền, dòng tế bào này
được chuyển đến Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ - American Type Culture Collection (ATCC). Vào năm 1979, ngân hàng tế bào tiên phát được thành lập từ một
ống tế bào cấy truyền lần thứ 124. Ngân hàng tế bào tiên phát được dùng để sáng lập ngân hàng tế bào đang làm việc (Manufacturer's Working Cells Bank – MWCBs). Dòng tế bào này được thử nghiệm nhiều lần để tiếp tục sử dụng cho việc sản xuất vaccin virus. Thậm chí, lấy dịch nuôi cấy tế bào tiêm vào chuột không có tuyến ức (mất khả năng đề kháng), kết quả nhận được là âm tính, không hình thành khối u. Thử
nghiệm DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ở lần cấy truyền 169, kết quả cho thấy lượng DNA tồn dư không đáng kể. Chính vì thế, lần cấy truyền 137
được dùng cho MWCB và lần cấy truyền 142 được dùng để sản xuất tế bào nuôi. Môi trường nuôi cấy tế bào chia làm hai loại, môi trường phát triển và môi trường duy trì. Môi trường phát triển chứa hàm lượng huyết thanh cao 8 – 10%, có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào. Huyết thanh bào thai bê là thích hợp nhất để
thúc đẩy sự phát triển của tế bào vì nó không chứa các yếu tốức chế tế bào.
Hình 2.8: Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép
trên thạch
(Nguồn: Terrance G.Copper, The tools of biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1977)
Tế bào vero tăng trưởng và được duy trì trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) có bổ sung thêm huyết thanh bào thai bê FBS (Fetal Bovine Serum). Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH bằng sodium bicarbonate và ủ trong tủấm CO2để duy trì pH 7.2 –7.4. Tế bào vero được nuôi cấy ở
37OC, 5% CO2.
2.7.2. Độc tố VT2e[4][9]
Vào năm 1977, Konowalchuk và các cộng sựđã đặt tên verotoxin (VT) cho một
độc tố do một dòng E. coli tiết ra và gây chết tế bào nuôi cấy. Trong một nghiên cứu trên 136 mẫu phân lập E. coli, 7 trong 10 trường hợp VT dương tính đã kéo theo bệnh tiêu chảy xảy ra ở người và một trường hợp kéo theo bệnh tiêu chảy ở heo. Trong một báo cáo vào năm 1982, O΄ Brient và các cộng tác viên đã cho rằng một vài chủng E. coli gây bệnh đường ruột đã tiết ra một độc tố gây chết tế bào Hela. Cũng giống như
các độc tố do Shigella tiết ra và gây độc làm chết tế bào Hela nuôi cấy, các độc tố này
ức chế sự tổng hợp protein trong các tế bào Hela và gây chết chuột. Vì thế, các độc tố
này được gọi là Shiga-like toxin (SLT).
Vào năm 1983, O΄Brient và LaCeck đã tinh chế SLT và đã chứng minh rằng Shiga toxin do Shigella dysenteriae tiết ra và SLT được tiết từ chủng E. coli H30 là giống nhau về các đặc tính lý hoá và hoạt tính hoá học.
Độc tố SLT-II variant (Shiga-like toxin IIv, SLT-IIv) hay VT2e là một độc tố
có đặc trưng gây độc trên môi trường nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney) hơn là trên tế bào Hela. Độc tố VT2e bị trung hòa một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I. Độc tố SLT-IIv là một phân tử
gồm 2 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị A khoảng 33 kDa và 5 tiểu đơn vị B khoảng 7.7 kDa/đơn vị. Tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme, trong khi tiểu đơn vị B chịu trách nhiệm cho sự liên kết các SLT với thụ thể có bản chất là glycolipid. Thụ thể cho SLT- IIv là Globotetraosyl ceramide (Gb4) trên màng tế bào vero. Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (Elongation Factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với tiểu phần 60S của RNA ribosome, do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế bào.
2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero
Khi kháng thểđặc hiệu gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm mất hoạt tính của độc tố, do đó độc tố không còn gây độc đối với cơ thểđộng vật. Phản ứng đó
được gọi là phản ứng trung hòa độc tố.
Trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, độc tố verotoxin sẽ liên kết với các thụ
thể đặc hiệu (Gb4) có trên màng tế bào rồi cản trở sự tổng hợp protein của tế bào và gây chết tế bào. Nếu độc tố này được ủ với kháng huyết thanh chứa kháng thể của độc tố này, thì kháng thể có trong huyết thanh sẽ liên kết với độc tố làm bất hoạt độc tố và tế bào không bị chết. Dựa trên sự quan sát độ phân tách của tế bào người ta có thể biết
được là tế bào chết hay không. Căn cứ trên nồng độ huyết thanh trung hòa được lượng
độc tốở liều TCID50 người ta có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh và đánh giá hiệu quả của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
Protein MBP-VT2eB được tạo ra dựa trên tiểu phần B của độc tố VT2e qui
định khả năng liên kết với các thụ thể đặc trưng trên tế bào đích. Do đó khi tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2e vào thỏ thì cơ thể thỏ sẽ tạo ra một cơ chếđáp ứng miễn dịch dịch thể và sản xuất kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e. Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thểđặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả
năng gây bệnh. Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên môi trường nuôi cấy tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh. Nhờđó đánh giá được khả
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: từ 14/02/2005 đến 30/07/2005.
Địa điểm thực hiện:
Trại thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng miễn dịch viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
Phòng kiểm định vaccin viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ.
3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT
3.3.1. Thú thí nghiệm:
5 con thỏ, trọng lượng từ 1,5 – 2 kg.
3.3.2. Vật liệu và hoá chất
Dung dịch Ammonium Sulfate 100%S Dung dịch Ammonium Sulfate 45%S Dung dịch PBS 1X
Dung dịch PBS++ Dung dịch PBS-
Dung dịch Sodium azide NaN3 5% Tá chất Aluminum hydroxide Al(OH)3
Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Dung dịch Versene 0,2% Dung dịch Trypsin 0,5%
Huyết thanh bào thai bê (FBS – Fetal Bovine Serum) Dung dịch Formol 3,7%
Dung dịch Borat 0,01M, pH 8.5 Dung dịch Methylene Blue 1%
Dịch chiết canh cấy chủng E. coli DH5α: VT2e- Thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%
3.3.3. Môi trường
Môi trường DMEM (Dulbeccos Minimal Essential Medium) (Gibco).
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ
Máy khuấy từ CAT M6/1
Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments Tủ cấy vô trùng
Tủấm 37oC
Chai nuôi cấy tế bào 25, 80 cm2 Phiến polystyren 96 giếng
Tấm plastic dán phiến polystyren 96 giếng Pipette 8 kênh
Pipette tựđộng Pipette 100 µl
Đầu côn vàng tiệt trùng Máng nhựa tiệt trùng
Ống nghiệm thuỷ tinh 3 ml Kính hiển vi soi ngược IOD3 Xi lanh loại 1 ml, 20 ml
Ống ly tâm 50 ml Eppendoft 1,5 ml
Buồng đếm hồng cầu GASSALEM. Tủ lạnh 2 – 8oC.
Cân phân tích Explorer OHAUS Màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo 2 quy trình. Vị trí tiêm: tiêm dưới da
Quy trình ngắn ngày (theo R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [13]
Thí nghiệm trên 2 con thỏ, 5 ngày tiêm 1 lần, tiêm 5 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tăng dần từ 50 µg/ml đến 100 µg/ml.
- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)
- Ngày 1: tiêm 0,5 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 5: tiêm 1 ml với liều 75 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 9: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)
- Ngày 10: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 14: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)
- Ngày 15: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 19: lấy 1 ml (mũi nhắc lại 3)
- Ngày 20: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 25: lấy 40 ml máu
- Ngày 30: lấy 40 ml máu - Ngày 35: lấy máu tim
Quy trình dài ngày (quy trình viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh)
Thí nghiệm trên 3 con thỏ, 28 ngày tiêm 1 lần, tiêm 6 lần với liều protein tái tổ hợp MBP-VT2eB giảm dần từ 100 µg/ml xuống 50 µg/ml.
- Ngày 0: lấy 1 ml máu (đối chứng)
- Ngày 1: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 28: tiêm 1 ml với liều 100 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 42: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 1)
- Ngày 56: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 70: lấy 1 ml máu (mũi nhắc lại 2)
- Ngày 84: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml. - Ngày 98: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 3)
- Ngày 112: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 126: lấy 50 ml máu (mũi nhắc lại 4)
- Ngày 140: tiêm 1 ml với liều 50 µg MBP-VT2eB/ml - Ngày 154: lấy máu tim
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm
Chuẩn bị dịch Al(OH)3 vô trùng.
Pha protein tái tổ hợp với dung dịch Al(OH)3 đểđạt hàm lượng 50 µg, 75 µg và 100 µg MBP-VT2eB/ml.
Sau đó lắc đều trong thời gian 45 phút. Phân phối vào các chai nhỏ 1 ml/chai, bảo quản ở 4oC cho đến khi tiêm.
3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh
Lấy máu (40 ml/con, 50 ml/con):
Trước khi lấy máu, tráng ống bằng nước muối sinh lý 0,85%.
o Vnước muối sinh lý = 0,2% Vmáu
Lấy máu ở tĩnh mạch tai thỏ vào ống 50 ml.
Sau khi lấy máu xong, dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống.
Để qua đêm ở 4oC, ly tâm tách kháng huyết thanh chia làm hai phần: - Phần 1: có bổ sung NaN3, VNaN3 = 0,05% Vmáu, bảo quản ở 4oC. - Phần 2: không bổ sung NaN3, bảo quản ở -20oC.
3.4.4.Xử lý kháng huyết thanh
3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S
Nguyên tắc[10][12]
Phương pháp kết tủa protein được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng muối vô cơ như ammonium sulfate, potassium sulfate, sodium sulfate.
Khi ammonium sulfate hoà tan, một số lượng lớn các phân tử nước sẽ bám xung quanh các phân tử ammonium sulfate. Khi số lượng các phân tử ammonium sulfate trong dung dịch tăng lên thì số lượng các phân tử nước kết hợp với protein sẽ giảm xuống. Cuối cùng, không còn đủ nước kết hợp với protein để tạo thành dung dịch hoà tan và protein bắt đầu kết tủa. Đây còn được gọi là tiến trình mất nước của protein. Sau khi nhỏ từ từ hết ammonium sulfate 100%S, tiếp tục khuấy 45 – 60 phút để hoà tan hoàn toàn ammonium sulfate.
Tiến hành
3.4.4.2. Hòa tan kháng thể
Kháng thể tủa trong dung dịch ammonium sulfate 45%S được phục hồi bằng phương pháp thẩm tích.
Nguyên tắc[12]
Một trong những phương pháp dùng để loại muối ammonium sulfate 45%S là sử dụng bao thẩm tích. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ, chúng cho phép các phân tử muối nhỏ dễ dàng di chuyển qua lại nhưng không cho phép các