Xây dựng quy trình RT-PCR phát hiện virus PRRS từ ba nguồn Taq khác nhau. Xây dựng quy trình điện di để phát hiện RNA tổng số.
Ly trích RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh của heo nghi nhiễm PRRSV bằng cách sử dụng hai phương pháp ly trích theo bộ kit và sử dụng TRIzol.
Chẩn đoán virus PRRS từ mẫu thu nhận bằng quy trình RT-PCR đã thiết lập.
3.3. Vật liệu và hoá chất 3.3.1. Mẫu xét nghiệm
Mẫu RNA chuẩn được cung cấp từ Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan (Pháp).
Mẫu nuôi cấy tế bào (trước đó đã kiểm tra cho kết quả ELISA dương tính) được cung cấp từ Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh: 10 mẫu
Mẫu huyết thanh và mẫu phổi được thu nhận từ các trại heo: 71 lượt mẫu. Trong đó mẫu huyết thanh là 41 mẫu, mẫu phổi là 6 mẫu.
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR
Cặp primer theo tác giả Rovira được thiết kế dựa vào trình tự của vùng đọc mở số 7 (ORF7) của virus PRRS giống Olot/91 (Rovira và cộng sự) và được cung cấp bởi công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp.
Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau:
Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng
Tên Trình tự nucleotide (5’ đến 3’) Vị trí trên genome
P1 CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 14647 đến 14667 (Lelystad) 2948 đến 2968 (VR2332) P2 GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 14938 đến 14918 (Lelystad)
3248 đến 3228 (VR2332) Rovira 1 CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA Độ dài đoạn gene nhân lên:
400bp Rovira 2 GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC