Diếp cá để định lượng quercetin:
Tiến hành chiết và theo dõi:
- Thời gian để phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn: dịch thủy phân sau mỗi 1 giờ được chiết kiệt Quercetin bằng CHCl3, theo dõi các dịch thủy phân sau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,...
- Quá trình loại tạp.
Theo dõi bằng thuốc thử FeCl3 trong cồn và sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn.
Quy trình chuẩn bị mẫu thử cao Diếp cá:
Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 10 ml ethanol 25%, lọc, chuyển vào bình lắng gạn, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1).
Dịch A1 cho qua cột SPE tự chế để loại tạp. Cho 20 ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn (A2).
Hòa tan cắn A2 trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ vài ml dung dịch đầu trước khi bơm vào hệ thống.
Quy trình chuẩn bị mẫu thử viên nang chứa Cao diếp cá:
Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10 ml cồn 25%, lọc thu lấy dịch lọc, rửa cắn với khoảng 2 ml cồn 25%, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với 20
ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1).
Các bước còn lại xử lý như đối với mẫu thử cao Diếp cá.
Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử.
HCl 10% / cồn 25% Thủy phân 3h Cao Diếp cá (Viên Diếp cá) Dịch cồn 25% Dịch thủy phân Dịch CHCl3 Dịch CHCl 3 đậm đặc
Hòa tan vào cồn 25%, lọc
Lắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3
Lắc với H2O, gạn bỏ lớp nước. Lọc qua Na2SO4 Cô đến dịch CHCl3 đậm đặc Lắc với CHCl3 3 lần Dịch SPE chứa Quercetin Cột SPE tự chế Cắn Cô đến cắn