3.3.3.3 Phân lập
Từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV, dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập từ khuẩn dịch tăng sinh chọn lọc sang đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng XLD sao cho có thể tạo được những khuẩn lạc tách rời nhau. Lật ngược đĩa ủ ở 37 1oC trong 24 giờ. Lý do để lựa chọn môi trường này vì nó có tính chọn lọc tương đối yếu, cũng như chúng tôi muốn tạo thuận lợi cho việc tăng sinh tối đa các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella, vừa ức chế việc mọc của các vi khuẩn khác và như thế sẽ hạn chế sai sót. Nhờ vào môi trường phân lập này vừa phối hợp tăng sinh sẽ làm tăng khả năng phát hiện chủng vi khuẩn mong muốn.
Trên môi trường XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen ở giữa, lớn, bóng.
Bao giờ cũng có thể nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ, đặc biệt khi
Salmonella mọc dày trong môi trường. [20]
Kinh nghiệm là điều rất quan trọng trong việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella. Hình thái của chúng ít nhiều có biến động, không chỉ theo kiểu kháng huyết thanh mà còn theo sự khác biệt giữa các lô môi trường được sử dụng.
Hình 3.2 Môi trường XLD trước khi cấy
Hình 3.3 Hình dạng khuẩn lạc của Salmonella trên XLD 3.3.3.4 Phục hồi
Chọn ít nhất 3 – 5 khuẩn lạc điển hình hay nghi ngờ ở mỗi đĩa cấy trong giai đoạn phân lập chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc Tryptic Soy Agar (TSA) để nhân sinh khối và phục hồi chủng vi sinh vật phân lập được từ thực phẩm để tiến hành thực hiện các thí nghiệm tiếp theo, ủ ở 37 1o
C trong 18 – 24 giờ.
3.3.3.5 Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa
Những khuẩn lạc nghi ngờ phải được kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. Cần tiến hành kiểm tra khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa phù hợp. Theo chúng tôi để kiểm tra định tính Salmonella chỉ xác định đến giống Salmonella, không cần đến loài, thì kết quả một số thử nghiệm sinh hóa phù hợp là hoàn toàn đủ để đi đến kết luận khẳng định. Trong trường hợp này các phản ứng huyết thanh chỉ mang tính hỗ trợ. [1]
Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bốn phản ứng sinh hóa trên các môi trường TSI, Mannitol phenol red broth, Urea phenol red both và LDC broth.
Thử nghiệm trên môi trường TSI: Thử nghiệm khả năng lên men lactose, glucose và sinh khí H2S. Dùng que cấy nhọn lấy sinh khối từ môi trường phục hồi TSA cấy đâm sâu vào phần thạch sâu, rồi cấy ria trên bề mặt phần thạch nghiêng. Ủ ở 37o
C trong 24 giờ, Salmonella sinh trưởng làm môi trường ở phần thạch nghiêng chuyển thành màu đỏ (kiềm), phần thạch sâu chuyển thành màu vàng (acid) do chúng không lên men được lactose mà chỉ lên men glucose. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng tạo thành khí H2S nên trong môi trường xuất hiện những vệt đen bên trong thạch hay trên bề mặt thạch nghiêng. Vặn nút ống nghiệm hơi lỏng để duy trì điều kiện hiếu khí khi ủ các thạch nghiêng do tránh sự tạo thành quá nhiều H2S. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm. [9]
Thử nghiệm khả năng lên men đường mannitol: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường Mannitol phenol red broth. Ủ ở 37oC trong 24 giờ, Salmonella lên men và sinh acid từ mannitol nên môi trường sau nuôi cấy chuyển sang màu vàng. [20]
Thử nghiệm khả năng tổng hợp enzyme lysine decarboxylase: dùng que cấy vòng chuyển sinh khối từ môi trường TSA sang môi trường LDC broth. Ủ ở 37o
trong 24 giờ, Salmonella cho phản ứng kiềm có biểu hiện LDC dương tính khi môi trường có sinh khối và chuyển sang màu tím hoặc màu xanh.
Thử nghiệm khả năng phân giải urea: dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường TSA cấy chuyển sang môi trường Urea phenol red broth. Ủ ở 37o
C trong 24 giờ, Salmonella không thủy giải urea nên không làm chuyển màu môi trường. Những vi sinh vật có phản ứng urea dương tính làm tăng pH môi trường nên sau khi nuôi cấy môi trường chuyển sang màu đỏ hồng.
Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella spp. được trình bày trong Bảng 3.2 Bảng 3.2Biểu hiện sinh hóa của Salmonella spp.
Môi trƣờng Phản ứng Biểu hiện của môi trƣờng
TSI H2S Sinh khí + / - + / - Phần nghiêng đỏ/phần sâu vàng Có hay không có vệt đen
Có hay không có sinh khí Lysine Decaroxylase broth + Chuyển từ xanh sang tím
Mannitol phenol red broth + Chuyển từ đỏ sang vàng, đục đều
Urea phenol red broth - Không đổi màu
1 a b a b 5 4 3 2 6 7 8
Hình3.4 Môi trƣờng thử nghiệm sinh hóa Salmonella spp. trƣớc và sau khi nuôi cấy vi sinh vật