4) Nhân tố sinh trưởng
13.1.4.Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng
Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 1043 tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của mỗi tế bào là 10-12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng.
Thuật ngữ “các chất dinh dưỡng hạn chế” được sử dụng với rất nhiều ý nghĩa, và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hóa học và và động học. Sự hạn chế hóa học được định nghĩa là khối lượng lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng. “Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tìm ra rằng hàm lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng, miễn là tất cả các chất dinh dưỡng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình 1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ). Điều khiển động học về tốc độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trình Monod (phương trình 2) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất dinh dưỡng đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ).
X = X0 + ( S0 - S) x YX/S (1)
μ = μmax x x s / (KS + S) (2)
Trong đó S0 là nồng độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh dưỡng bị hạn chế S; X(X0) là nồng độ sinh khối (ban đầu); là sản lượng sinh khối thu được đối với chất dinh dưỡng S, μmax là tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, và KS là hằng số ái lực cơ chất Monod.
Điều này thể hiện rõ trong hình 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy kín. Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau đó tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn. Đó là lúc đạt đến nồng độ cuối cùng của sinh khối. Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường một cách liên tục và một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tốc độ bổ sung thêm vào của các chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả μ và nồng độ sinh khối trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998).
Hình 13.2: Động học của sự giới hạn sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy đóng do giới hạn nồng độ của chất dinh dưỡng (cơ chất) S. S0 là nồng độ cơ chất ban đầu, s là nồng độ thực của cơ chất, X là nồng độ sinh khối; X0: nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu được đối với
cơ chất S.
Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã được biết rõ, nhờ đó các chất dinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối, môi trường được thiết kế phổ biến với nguồn carbon và năng lượng giới hạn, tất cả các chất dinh dưỡng khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trình công nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưỡng chứ không phải nguồn carbon giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự hạn chế các chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzyme của vi sinh vật. Ví dụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quá trình lên men tạo chất kháng sinh do sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất acid citric trong môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp của NAD là được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học- bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen.
Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời (Kovarova và Egli, 1998).