II/ CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM.
1/Phương pháp nhuộm gram (Christian Gram): Dùng phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm.
ØNguyên tắc:
Nhuộm Gram, là phương pháp nhuộm thơng thường nhất trong các phịng thí nghiệm vi sinh. Phương pháp nhuộm Gram cho phép xác định được hình dạng, cách sắp xếp, và
51
phân biệt vikhuẩn là thuộc loại Gram[+] hay Gram [-]. Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode khơng bị tẩy màu bởi alcool, trong khi vi khuẩn Gram [-] khơng giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, cịn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng của phẩm màu safranin hay fuchsin.
ØThao tác:
- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh
chữ U, trên thau nhựa.
- Đặt miếng giấy lọc lên vịng phết kính.
- Nhỏ dd Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút (
nếu vi khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ). Rửa nước, thấm khơ.
- Tẩy cồn 96o từ 15 – 30 giây ( từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ
thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ). Rửa nước, thấm khơ. Tẩy cồn
bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím.
- Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin
kiềm lỗng (hoặc Safranin O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khơ.
- Quan sát bằng vật kính dầu, độ phĩng đại 1.000 lần.
Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn Gr– bắt màu
hồng Fuschin(Safranin O).
Chú ý:
- Trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng
giấy lọc phủ lên vết bơi.
52
Hình 23: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram
Ø Đọc kết quả:
- Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật
kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi khuẩn Gram[+] ăn màu tím, cịn vi khuẩn Gram[-] ăn màu hồng.
- Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các
chi tiết sau:
+ Hình dáng vi khuẩn.
+ Cách sắp xếp các vi khuẩn.
+ Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[+] hay Gram [-].
2/ Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen: Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác: