b) Exonuclease: Xúc tác cho quá trình phân giải lần lượt từng nucleotide ra khỏi chuỗ
6.2.5.Sinh tổng hợp acid desoxyribonucleic (DNA).
Sinh tổng hợp DNA là quá trình sao chép chính xác phân tử DNA đầu tiên. Trên cơ sở mô hình phân tử DNA của Watson và Crick. Sự tái tạo DNA xảy ra bằng cách liên kết hydro giữa 2 chuỗi bổ sung bị đứt và tách rời nhau ra. Mỗi một chuỗi có khả năng kết hợp với các desoxyribonucleotide triphosphate tự do, tạo thành chuỗi polyribonucleotide mới khớp hợp với chuỗi ban đầu. DNA mới giống với DNA ban đầu về thành phần và trật tự các nucleotide .
Cơ chế sao chép bán bảo tồn.
Quá trình tự sao, một sợi giữ nguyên, một sợi mới được tổng hợp được gọi là cơ chế sao chép bán bảo tồn, điều này đã được Meselson và Stahl chứng minh bằng cách nuôi E.coli trong môi trường có nitơ đánh dấu 15 N (15 NH4Cl), DNA được tồng hợp chỗ chứa 15N. Sau đó nuôi cấy ở môi trường 14 N thì thấy DNA ở thế hệ thứ nhất là dạng lai, gồm một sợi 15
N và một sợi 14 N. Thế hệ thứ 2 có 50% DNA dạng lai và 50% dạng chỉ có 14 N (các băng của DNA tìm thấy bằng li tâm nồng độ CsCl) (Hình 2.25, 2.26)
Hình 2.25: Các băng DNA của thí nghiêm Meselson và Stahl.
Cơ chế của quá trình tự sao DNA.
Enzyme tổng hợp DNA. Năm 1956, Kornberg đã tách được Enzyme DNA polymerase từ E.coli. Enzyme này có khả năng xúc tác quá trình tổng hợp DNA từ các desoxyribonucleoside triphosphate. Sau đó người ta đã tách được Enzyme này từ vi khuẩn, thực vật và động vật.
DNA polimenase xúc tác sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3’-OH ở đầu sinh trưởng của chuỗi DNA (mồi) và nhóm 5’-phophate của desoxyribonucleoside
Nhẹ hơn
Nhẹ
Trung bình Nặng
triphosphate mới (hình 2.26) sự sinh trưởng theo chiều 5’-->3’. Trong quá trình này có DNA làm khuôn. DNA khuôn thực hiện nguyên tắc ghép đôi bổ sung: A-T, C-G (hình 2.27).
Các giai đoạn sinh tổng hợp DNA
Mở xoắn: dưới tác dụng của DNA derulase, xoắn kép DNA được mở có 1 loại protein SSB (Single StDNA Binding) gắn vào sợi đơn DNA để phân tử DNA luôn ở dạng mở.
Tổng hợp RNA mồi: Dựa vào khuôn sợi đơn DNA, một đoạn RNA mồi được tổng hợp vói sự xúc tác của RNA-polymerase.
Sự kéo dài sợi DNA: Sau khi có RNA mồi, RNA mồi sẽ tạo ra nhóm 3’-OH tự do,để sau đó DNA polymerase bắt đầu hoạt động tái bản.
Mỗi một nucleoside triphosphate được ghép vào bằng liên kết phosphodiester ở C-5’, chiều tổng hợp là 5’---> 3’. Như vậy có 1 sợi được tổng hợp liên tục gọi là sợi hướng dẫn, còn sợi kia tổng hợp từng đoạn ngắn cùng với sự mở xoắn, gọi là sợi đi theo. Từng đoạn ngắn đó gọi là đoạn Okazaki (tên nhà bác học Nhật bản phát hiện chúng ở E.coli được công bố năm 1968). Ở E.coli đoạn ngắn này có hằng số lắng 8-10s, chiều dài 1000-2000 nucleotide, đoạn 10s có thể được tạo thành từ vài đoạn 3-5s. Ở tế bào động vật đoạn này ngắn hơn nhiều, nó có
khoảng 100-200 gốc nucleotide, hằng số lắng 4-5s. Ở giai đoạn này RNA mới được loại bỏ bởi endonuclease, và đoạn đó được tổng hợp lại bởi DNA polymerase. Các đoạn Okazaki được nối với nhau bằng DNA-ligase (Hình 2.28; 2.29; 2.30).
(dNMP)n+dNTP⎯Mg⎯ →⎯2+ (dNMP)n+1+PP
DNA Polimerase
DNA mồi
Hình 2.27. Sự sinh trưởng của DNA
Khuôn
M
ồ
i
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 68
Sự biểu hiện thông tin di truyền là sự truyền tín hiệu từ DNA sang RNA. Nhìn chung, sợi RNA có thể hoàn toàn giống với sợi DNA chỉ khác là có nhóm hydroxyl ở vị trí 2’ và uracil thay bằng thymine, song RNA có cấu trúc đa dạng hơn DNA và kèm theo sự khác nhau về chức phận. Phân tử RNA không thể hướng dẫn và thông tin nhanh chóng di truyền như DNA, RNA còn có thể hoạt động như là chất xúc tác.
Sự phát hiện ra RNA còn có chức phận xúc tác đã làm thay đổi rất nhiều của từ “Enzyme”. Nhiều RNA là phức chất của protein, tạo nên cơ chế phức tạp với nhiều chức phận khác nhau.
Hình 2
Hình 2.28: Tái bản DNA Hình 2.30. Chạc ba tái bản (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2. 30. Các đoạn Okazaki nối với nhau
RNA mồi mồi
5’
Hình thành Tổng hợp Cắt rời RNA và 1 sợi RNA DNA mới thay thế bằng DNA
Hình 2.29. Khởi đầu tái bản RNA Polimenrase
5’ 5’ 5’ Điểm khởiđầu 5’ Điểm khởiđầu 3’ RNA polymerase phụ thuộc DNA mở xoắn chuỗi DNA Enzyme derulase RNA mồi Mỗi thứ 1 Mỗi thứ 2 Tổng hợp DNA bởi DNA - plimerase
RNA RNA mới
mồi hình thành
Loại bỏ RNA mồi bởi endonaclease hình thành
đoạn okaseki
Nối lại bởi Ligase Relicase DNAliên kết protein (SSB) Primenson Primenson Primase Mồi HoloEnzyme DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase Sợi dẫn đường Sợi đi theo
Tổng hợp RNA phụ thuộc DNA.
Ở sinh vật nhân xơ (procaryote) chỉ có 1 loại Enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA thực hiện sự sao chép.
Ở sinh vật nhân chuẩn (Eucaryote) có 3 loại RNA polymerase, mỗi loại có 1 chức năng riêng. Phân tử RNA được hình thành trong nhân, sau đó chuyển ra tế bào chất để hoạt động. Sự sao chép RNA chỉ thực hiên trên 1 sợi của DNA, hướng sao chép từ 5’-P -->3’-OH. RNA -Polymerase xúc tác tổng hợp RNA từ các ribonucleotide 5’-phosphate (ATP, GTP, UTP và CTP). Sự tăng trưởng sợi RNA bằng cách kết hợp các ribonucleotide ở đầu 3’-OH của chuỗi RNA
(MMP)n + NTP ---> (MMP)n+1 + PP RNA Kéo dài RNA
Hình 2.31. Sự sao chép RNA
Sự sao chép chỉ xảy ra trên 1 sợi DNA làm khuôn, mỗi 1 nucleotide liên kết để tạo thành RNA mới được lựa chọn theo nguyên tắc cặp base bổ xung Watson-Crick. Uridine (U) trong RNA đối diện với Adenine (A) trong khuôn DNA, Adenine đối diện với Thymine, Guanine và Cytosine trong DNA đối diên với Cytosine và Guanine trong RNA mới.
RNA polymerase Tháo xoắn
Sợi không làm khuôn Bong bóng phiên mã
RNA-DNA lai Sợi khuôn Hướng phiên mã
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 70
Sợi DNA dùng để làm khuôn cho tổng hợp DNA gọi là xơi khuôn hay sợi trừ (-). Sợi
Khác với DNA polymerase, RNA polymerase không cần mầm để khởi đầu tổng hợp. Sự khởi đầu tổng hợp ở 1 đoạn đặc biệt gọi là gen khởi đầu (RNA được tổng hợp vẫn có 5’- triphosphate) ở gốc GTP và ATP trong quá trình phiên mã). Trong quá trình phiên mã tạo thành đoạn xoắn kép giữa RNA và DNA khuôn gọi là đoạn xoắn kép lai RNA-DNA (hình 2.32a). RNA trong sợi xoắn kép này lại được tách ra khỏi DNA.
Sự tổng hợp RNA xảy ra trên một sợi DNA, nên sợi xoắn kếp DNA phải tháo xoắn, vùng tháo xoắn để phiên mã như là “bong bóng”. Ở E.coli vùng này khoảng 17 cặp base được tháo rời. Sự tháo DNA ở phía trước và cuộn lại ở phía sau. Quá trình này làm cho phân tử DNA quay đáng kể (hình 2.32 b), nếu quay về phía trước chuỗi là siêu xoắn dương, và nếu quay về phía sau là siêu xoắn âm. Ở E.coli sự phiên mã với tốc độ 50 nucleotide 1giây.
DNA bổ sung với sợi khuôn gọi là sợi không làm khuôn hay sợi cộng (+), các base của nó rất giống với RNA được phiên mã chỉ khác U thay T. Sợi không làm khuôn thỉnh thoảng còn gọi là sợi mã hoá (hình 2.33)
(5’) CGCTATAGCGTTT (3’) sợi DNA không làm khuôn (+) (3’) GCGATAT CGCAAA (5’) Sợi DNA khuôn (-)
(5’) CGCUAUAGCGUUU (3’) RNA phiên mã.
Hình 2.33: Hai sợi bổ sung của DNA được xác định rõ chức phận trong phiên mã.
Cấu trúc và hoạt động của RNA polymerase.
Ở Ecoli RNA polymerase đơn phụ thuộc DNA tổng hợp các loại RNA khá lớn (KLPT: 390.000) phức chất Enzyme này có 5 tiểu đơn vị là lõi Enzyme và 1 tiểu đơn vị thứ 6 là δ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(xích ma) hày δ 70 (KLPT: 70 000) nó liên kết tạm thời với một lõi và hướng dẫn Enzyme đến vị trí khởi đầu đặc biệt trên DNA, 6 tiểu đơn vị này tạo thành holoEnzyme RNA polymerase (hình 2.34) Tiểu đơn vị β’ α ω β α δ Lõi Enzyme TLPT: α - 36.500, β - 151.000, β’ - 155.000 ω - 11.000, δ - 70.000. Tiểu phần βđược cho rằng là vị trí xúc táctổng hợp RNA
Hình 2.34. HaloEnzyme RNA polymerase.
Yếu tố δ còn gọi là yếu tố khởi động (yếu tố mồi) gắn vào RNA polymerase để nhận biết mã (codon) khởi đầu sao chép. Khi bắt đầu sao chép nó sẽ tách rời yếu tốρ (rô) còn gọi là yếu tố kết thúc. Khi kết thúc thì yếu tố ρ được giải phóng (hình 2.35). RNA polymerase trượt trên DNA để tổng hợp RNA theo hướng 5’-->3’. Đến vị trí kết thúc, yếu tố ρ gắn vào RNA polymerase để nhận biết mã kết thúc và yếu tố ρ được giải phóng, RNA polymerase tách khỏi sợi khuôn DNA.
Vùng khởi động.
Hình 2.36: 5 đoạn gen khởi đầu của E.coli, các đoạn gen này ở sợi mã hoá (không làm khuôn) và đọc từ 5’ →3’. Những vùng đệm số lượng nucleotide (N) có thể thay đổi.
Vùng –35 Vùng đệm Vùng-10 Vùng đệm Bắt đầu RNA +1 Trp TTGACA 17N TTAACT 7N A tRNA+Ty r TTTACA 16N TATGAT 7N A
Lac TTTACA 17N TATGTT 6N A
Rec A TTGATA 16N TATAAT 7N A
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 72 Đoạn
chung
TTGACA TATAAT
Sự khởi đầu tổng hợp RNA trên phân tử DNA là vùng đặc biệt ở vùng đó phân tử RNA polymerase liên kết với DNA và được gọi là gen khởi đầu. Ở vị khuẩn gen khởi đầu là 2 đoạn ngắn với khoảng 10 và 35 cặp base (Hình 2.36) RNA được tổng hợp là +1. Các đoạn gen khởi đầu không giống nhau, nhưng cũng có nhiều nucleotide chung. Phần lớn các gen khởi đầu của E.coli và vi khuẩn ở vùng –10 (còn gọi hộp Pribonow) là (5’) TAAAT (3’) và ở vùng –35 là (5’) TTGACA (3’)
m-RNA luôn luôn tạo ra AUG khởi đầu, phía trước AUG có một đoạn không ghi mã cho protein nào cả, chỉ để gắn vào ribosome.
Hình 2.37: Các giai đoạn trong sự khởi đầu phiên mã bởi RNA polymerase E.coli – RNA polymerase liên kết với gen khởi đầu cần phải 2 giai đoạn: Sự tạo thành của phức hệ đóng và mở – Tổng hợp RNA thông tin hầu như luôn luôn bắt đầu với nucleotide purine (Pu) – N là nucleotide bất kỳ.
RNA polymerase Gen khởi đầu
RNA polymerase hình thành phức hợp đóng ở vùng -35
Polymerase di chuyển đến vùng - 10 DNA được tháo ra tạo thành phức
Sợi khuôn Bắt đầu tổng hợp RNAm Nucleotide triphosphate purine NTP PP ∞ ∞∞ ∞ Tiểu phần ô tách ra khỏi polumerase vượt qua khởi