III: Kết quả và thảo luận
PHẦN III: MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN LẬP NẤM BỆNH VÀ NẤM ĐỐI KHÁNG.
Mỗi loại cây đều có một hệ vi sinh vật đặc trưng cho cây đó. Nghiên cứu về hệ vi sinh vật tham gia vào sự sinh trưởng, phát triển cũng như duy trì nòi giống ở thực vật là một trong những nội dung quan trọng giúp cho việc nâng cao sức sống, năng suất cũng như phẩm chất tốt của cây trồng.
*Nhóm vi sinh vật gây bệnh sống nhờ vào chất hữu cơ của thực vật đang sống, chúng tiết ra các hợp chất phân huỷ mô và tế bào thực vật làm cây chết (khác với nhóm hoại sinh- sống trên những tế bào thực vật đã chết). Vi sinh vật gây bệnh có khả năng tồn tại trong đất hoặc trên tàn dư thực vật từ vụ này qua vụ khác dưới dạng bào tử hoặc các dạng tiềm sinh khác tạo thành nguồn bệnh tiềm tàng. Từ đó chúng được phát tán nhờ nước mưa, gió, dụng cụ lao động, động vật và người, đặc biệt là nhờ côn trùng môi giới. Qua các con đường đó chúng lây lan sang cây khoẻ và bắt đầu nảy mầm, xâm nhiễm vào cây khi gặp điều kiện thuận lợi. Quá trình hoạt động của vi sinh vật gây bệnh làm cho cây bị thay đổi các đặc tính sinh lý, sinh hoá sau đó thay đổi về hình thái, cấu tạo tế bào và cuối cùng là xuất hiện những triệu chứng bệnh như đốm trên lá, trên thân…
Nấm chỉ chiếm khoảng dưới 1% tổng số vi sinh vật trong môi trường sống của thực vật nhưng lại có những ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển bình thường của hầu hết các loại cây trồng.
Cũng như các vi sinh vật gây bệnh khác nấm gây bệnh là một trong những nguyên nhân chính gây nên sự sụt giảm năng suất, chất lượng, tàn phá mùa màng.
Phần lớn nấm gây bệnh có hình thức sinh sản bằng bào tử và có vòng đời ngắn do đó chúng lây lan với một tốc độ vô cùng lớn và rất khó ngăn chặn. Chính vì vậy, việc phát hiện, nghiên cứu nấm bệnh là một nội dung vô cùng quan trọng giúp cho việc tìm ra các biện pháp phòng ngừa, tiêu diệt và ngăn chặn sự lây lan của chúng, bảo vệ mùa màng.
*Để tránh bệnh cho cây người ta sử dụng nhiều biện pháp hoá học, sinh học cũng như các biện pháp tổng hợp rất phong phú. Ngày nay, các biện pháp hoá học bị hạn chế do những tác động phá hoại sự cân bằng sinh thái hay gây ô nhiễm môi trường của chúng. Các biện pháp sinh học như sử dụng vi sinh vật đối kháng, thuốc trừ sâu sinh học, chuyển gen chống chịu vào cây trồng…đang được nghiên cứu và áp dụng ngày càng nhiều nhờ những ưu điểm của chúng.
Một trong những biện pháp sinh học có khả năng đem lại hiệu quả cao trong bảo vệ cây trồng là sử dụng vi sinh vật chống lại các vi sinh vật hại cây hay nói cách khác là tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho cây nhờ các vi sinh vật đối kháng với chúng.
Hiện nay, người ta đã tìm ra các cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh dựa vào các chủng vi sinh vật đối kháng như:
+ Sự cạnh tranh về dinh dưỡng. Các chủng vi sinh vật đối kháng thường phát triển nhanh làm biến đổi dinh dưỡng và không gian sống của vi sinh vật gây bệnh.
+ Sinh chất kháng nấm
+ Tăng sức đề kháng ở vật chủ: Một số chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sự tạo thành các chất chống chịu ở vật chủ.
+ Tác động trực tiếp vào tác nhân gây bệnh: một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh ra enzim thuỷ phân ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác, phân giải thành thành tế bào hay tạo ra các lỗ rò dẫn tới sự rò rỉ tế bào.. Nghiên cứu các vi sinh vật đối kháng thì nấm đối kháng là một nội dung mới mẻ và quan trọng, đang được đầu tư ở Việt Nam.
II.Phương pháp nghiên cứu
cây trồng cũng như sản xuất ra các chế phẩm sinh học nhờ những nghiên cứu ấy.
1.K ỹ thuật mồi nấm gây bệnh * Nguyên tắc:
- Sử dụng mô của cây chủ sạch bệnh để bắt các vi sinh vật gây bệnh cho cây cùng loại. Vi sinh vật có trong đất sẽ bị thu hút bởi mô thực vật mà nó có thể sống kí sinh và gây bệnh trên đó, nhờ vậy ta tách riêng được chủng VSV cần nghiên cứu.
* Cách tiến hành:
- Lấy mẫu đất bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh lấy từ cánh đồng, mang vào phòng thí nghiệm, phơi khô và nghiền nhỏ.
- Lấy 100g đất cho vào đĩa Petri đã khử trùng, thêm nước cất khử trùng để làm ẩm
- Cắt lá cây chủ sạch bệnh kích thước 1cm2 đặt vào đĩa đó (khoảng 10 miếng trên một đĩa).
- Giữ đĩa petri chứa đất ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của nấm trên mô chủ dưới kính hiển vi độ phóng đại x10.
- Cấy chuyển sang môi trường WA (hình 1) hoặc môi trường trung gian PDA cho đến khi tạo thành canh trường thuần khiết (hình 2)
- Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H1
* Phạm vi ứng dụng:
- Phương pháp này dùng để phân lập nấm gây bệnh trong đất
- Cũng có thể phân lập nấm có trong mô thực vật bằng cách đặt mẫu cần phân lập lên đất đã khử trùng sạch bệnh để nấm xâm nhiễm và được nhân lên nhờ đất. Sau đó phân lập nấm bệnh từ đất theo các bước trên.
2. K ỹ thuật tách vi sinh vật gây bệnh * Nguyên tắc:
- Nuôi mô thực vật bị nhiễm nấm bệnh trên môi trường nuôi cấy phù hợp để nấm phát triển mạnh mẽ tạo thành khuẩn lạc, nhờ đó tách riêng chúng. * Cách tiến hành:
- Các thành phần gây bệnh ở thực vật tập trung trên lá cây hoặc trên vỏ cành cây con và quả. Những mẫu đó được đưa tới PTN làm sạch dưới vòi nước chảy, sau đó khử trùng bề mặt bằng Clorox 10%.
- Cắt mảnh lá rộng 1-2mm2 chứa một nửa mô sạch và một nửa mô bệnh, sau đó ngâm trong Clorox 10% trong 5 phút
- Cấy mô đã khử trùng bề mặt trên môi trường WA, và giữ ở nhiệt độ phòng.
- Quan sát khuẩn lạc của nấm mốc mọc lên trong môi trường đó và cấy chuyển nhiều lần sang môi trường WA hoặc PDA cho đến khi tạo được canh trường thuần khiết.
- Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H2
* Phạm vi ứng dụng:
- Phân lập được các chủng nấm gây bệnh trực tiếp từ mô thực vật. 3.Ph ương pháp pha loãng
* Nguyên tắc:
- Nuôi cấy dung dịch loãng chứa VSV ở các nồng độ khác nhau trên môi trường phù hợp để tạo thành các khuẩn lạc. Nuôi cấy tách riêng các khuẩn lạc đó để thu được các chủng nấm riêng biệt.
- Thêm 10ml nước cất khử trùng để hoà tan đất sau đó lắc đều trong 20-30 phút.
- Pha loãng mẫu đất đã hoà tan trong nước cất khử trùng và cấy lên môi trường thạch thích hợp, mỗi độ pha loãng lấy 0.1ml.
- Giữ ở nhiệt độ 24-30oC trong vài ngày và đếm khuẩn lạc.
- Cấy chuyển nhiều lần trên môi trường thích hợp để tạo ra khuẩn lạc thuần khiết
- Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H3
* Phạm vi ứng dụng: - Phân lập VSV trong đất
- Xác định hàm lượng VSV trong đất 4. M ồi bắt vi sinh vật đối kháng: * Nguyên tắc:
- Tạo ra môi trường nghèo dinh dưỡng để VSV gây bệnh khó hoặc không phát triển được. Khi đó những VSV phát triển trên môi trường ấy hầu hết là VSV đối kháng (???)
* Cách tiến hành:
- Lấy 10 g đất tốt cho vào đĩa petri đã khử trùng - Phun nước cất khử trùng để làm ẩm đất
- Đặt lên bề mặt một lớp vật liệu cellulose (giấy hay rơm rạ ). - ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 ngày.
- Cấy chuyển bào tử nấm sang môi trường trung gian PDA cho đến khi tạo canh trường thuần khiết.
- Các bước trên thực hiện trong box cấy vô trùng Sơ đồ tiến hành: H4
* Phạm vi ứng dụng:
Phân lập được một số chủng nấm từ đất phục vụ cho việc nghiên cứu nấm đối kháng.
**Thành phần các môi trường sử dụng:
• Môi trường PDA:
Thành phần Hàm lượng -Đường glucose 20 g/l - Khoai tây 200g/l - Agar 20 g/l - Nước 1000ml • M ôi trường WA : Thành phần Hàm lượng - Agar 20 g/l - Nước 1000ml
Mẫu đất và nước khử trùng
Đặt vật liệu mồi chủ của mẫu lên bề mặt
cho nước vào và ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi trong 3-5 ngày
Quan sát dưới kính hiển vi (x10)
Tách sợi nấm chuyển sang môi trường PDA cho tới khuẩn lạc thuần
Định danh dưới kính hiển vi và chụp ảnh
H1: Kỹ thuật mồi nấm bệnh Phytophthora và Pythium
Phần bệnh và khoẻ
Làm sạch
Đặt vài miếng lên môi trường WA và ủ ở nhiệt độ phòng 3-5 ngày
Định danh dưới kính hiển vi và chụp ảnh
H2: Kỹ thuật tách nấm bệnh từ mẫu bệnh (theo Kasem soytong)
Lắc 20-30 1g mẫu đất + 10ml nước cất khử trùng 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 -2 -3 -4 -5 -6 0,1m l 0,1m l 0,1m l 0,1m l 0,1m l 0,1m l No 10-1 -2 _-3 -4 -5 -6 Môi trường
Đơn vị khuẩn lạc tạo thành (CFU)
Mẫu đất
( Phơi khô sau đó nghiền nhỏ lấy 100g đặt vào đĩa)
Đặt vật liệu mồi cellulose lên bề mặt (Giấy whatman hoặc cọng rơm)
ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 ngày và giữ ẩm sau đó quan sát dưới kính lúp
Phân lập tới khuẩn lạc thuần
III. Kết quả và thảo luận
1.K
ỹ thuật mồi nấm gây bệnh :
-Tiến hành thí nghiệm trên 2 mẫu đất trồng Cam ở Huyện Văn Giang, tỉnh Bắc Giang là: CVG1 và CVG2.
- Vi sinh vật phân lập được là nấm mốc Phytophthora : bào tử hình cầu, thành dày, sợi phát triển chậm.
2. K ỹ thuật tách vi sinh vật gây bệnh :
-Tiến hành thí nghiệm trên mẫu lá cây xoài ở Viện Di Truyền Nông Nghiệp
- Vi sinh vật phân lập được là ??? 3. K ỹ thuật pha loãng:
- Tiến hành thí nghiệm trên mẫu đất trồng Cam ở Huyện Văn Giang, tỉnh Bắc Giang là: CVG1 và mẫu đất trồng Hồng Môn tại VDTNN là HM1 - Các chủng vi sinh vật phân lập được là : Tricoderma; Aspergillus và
Penicillium
- Tiến hành thí nghiệm trên mẫu đất trồng Hồng Môn tại VDTNN là HM1T, tuy nhiên do thời gian thí nghiệm hạn chế nên chưa thu được kết quả.
- ( Giới thiệu 1 số chủng nấm đối kháng đã được các nhà khoa học phân lập: Tricoderma)
KẾT LUẬN
Sau 3 tuần thực tập kỹ thuật tại Viện Di truyền Nông nghịêp,em nhận thấy đây là một đợt thực tập bổ ích vì em đã có cơ hội hiểu rã hơn về một số vấn đề đã được học trong học kỳ vừa qua,được học tập trên thực tế chứ không phải chỉ trên lý thuyết vì thế em thấy mình nắm các vấn đề sâu hơn và dễ hiểu hơn.Đây là một số kết quả em nhận được sau đợt thực tập này:
- Biết rõ hơn về thực tế nghiên cứu chung. - Chẩn đoán bệnh cây.
- Tìm và phân lập nấm. - Nuôi cấy mô tế bào.
Qua đợt thực tập này em đã phần nào hình dung và định hướng được công việc mình sẽ là trong tương lai.Tuy đây là đợt thực tập thứ hai của em nhưng là đợt thực tập ký thuật đầu tiên nên không tránh được những bỡ ngỡ nên em rất mong có được sự góp ý và giúp đỡ của cô để em có thể hoàn thiện hơn kiến thức của mình.
Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Xuân Sâm, Hoàng Lan cùng các cô và các anh chị tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ em hoàn thành đợt thực tập này.