Phản ứng chuỗi PCR nhằm khuyếch đại ADN lần đầu tiên được Saki (1985) giới thiệu và đây được coi là một trong những tiến bộ khoa học quan trọng nhất về sinh học trong thập kỷ 80. Phản ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt tạo ra nhiều phiên bản theo hàm số mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi ADN sau vài giờ có thể nhân lên 1011 phiên bản ADN tương đương với 100 ng ADN. Sau khi thực hiện phản ứng PCR thì cần tiến hành một số kỹ thuật để xác định sản phẩm, đơn giản nhất là điện di và xác định kích thước của sản phẩm PCR. Trong các nghiên cứu chẩn đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa, nó chứng tỏ sự có mặt của ADN đích trong mẫu nghiên cứu. Có thể nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy cao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thông tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác định trình tự ADN của sản phẩm PCR.
Ngay từ khi được giới thiệu thì PCR đã được xem là phương pháp đưa lại kết quả khá nhạy trong việc xác định và phát hiện vi sinh vật. Tính ưu việt của nó thể hiện ở chỗ có thể chỉ cần một hạt virus hay một tế bào vi khuẩn nào đó cũng đủ cho phản ứng xảy ra và khuyếch đại tới mức có thể phát hiện được trong thời gian ngắn. Kỹ thuật PCR còn được dùng để nhân ADN từ khuôn RNA sau khi đã được chuyển thành cDNA sau phản ứng phiên mã ngược (RT). Phương pháp này nhanh chóng được chú ý và trở lên phổ biến cho các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn hay virus ở nồng độ thấp trong các mẫu môi trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc phát hiện mẫu máu nhiễm HIV có nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN của virus trong hệ gene người có kích thước gấp 100 000 lần. Mặt khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch với kháng thể thì phải cần tới 8 ngày mới có đáp ứng miễn dịch trong máu, trong khi đó với kỹ thuật PCR thì toàn bộ quy trình phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với nguồn ADN hay RNA). Lợi thế của kỹ thuật PCR được tận dụng cho việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với số lượng lớn cho các phép lai ADN đã trình bày ở trên. Các mẫu dò có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hay phi phóng xạ khi tiến hành phản ứng khuyếch đại. Mẫu dò đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu thế hơn các phương pháp đánh dấu truyền thống bằng kỹ thuật tổng hợp các mạch đứt gãy (nick translation) hay đánh dấu với mồi ngẫu nhiên (rADN random primer labeling). Các ưu thế này có thể kể đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ sợi ADN khuôn, có thể tiến hành đánh dấu với các mẫu dò có kích thước ngắn, chuẩn bị mẫu dò không cần tinh sạch ADN khuôn. Bảng 1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụ ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát hiện nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau. Rất nhiều các kết quả nghiên cứu như vậy được trình bày trong các tạp chí chuyên ngành như: ành như: ành như: ành như: Journal of Clinical Microbiology, Applied Environmental Microbiology.
Vi sinh vật Tài liệu
Acanthamoeba sp Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Brucella sp Candida albicans Carnobacterium spp Chlamydia trachomatis Clostridium difficile Coxiella burneti Cryptosporidium parvum Cytomegalovirus Dengue virus Epstein-barr virus Erwinia amylovora Escherichia coli Frankia spp Gaeumannomyces spp Helicobacter pylori Hepatitis C virus
Human immunodeficiency virus (HIV) Influenza virus Leptospira spp Litsteria monocytogenees Luteovirus Vokin et al (1992) Houard et al (1989)
Marconi ADN Garon (1992) Herman an Derider (1992) Miyakawa et al (1992) Brook et al (1992) Hayes et al (1992) Gumerlock et al (1991) Stein an Raoult (1992) Laxer et al (1991) Gozlan et al (1991) Henchal et al (1991) Samoszuk (1991) Bereswill etal (1992) Jackson (1992) Simonet et al (1990) Henson (1992) Claton et al (1992) Okamoto et al (1992) Dawood et al (1992) Claas et al (1992) Merien et al (1992) Niederhauser et al (1992) Robertson et al (1991)
Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitis Papillomavirus Parvovirus Plsmodium falciparum Pneumocystis carini Polio virus Pseudomonas solanacearum Rickettsia spp Rotavirus Salmonella spp Staphylococcus spp Toxoplasma gondii Treponema pallidum Trichomonas vaginalis Trypanosoma cruzi Vibrio vulnificus Yersinia Hackel et al (1990) Altamirano et al (1992) Maiden et al(1992) Charlotte et al (1993) McOmish et al (1993) Barker et al (1992) Olsson et al (1993) Yang et al (1991) Seal et al (1992a) Gage et al (1992) Taniguchi et al (1992) Rahn et al (1992) Murakami et al (1991) Vanevan et al (1991) Grimprel et al (1991) Riley et al (1992) Breniere et al (1992) Hill et al (1991) Nakajima et al (1992)
Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR: Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều
5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC và như vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại 755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong 230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.
+ Các thông số kỹ thuật:
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg++ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dưới đây.
Thành phần Số lượng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM Taq polymerase 1 U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05%
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu, điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.
Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản ứng PCR:
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễm ADN đều có thể đưa đến sản phẩm dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết được sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm.
Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số lượng tương ứng khoảng 40 000 nucleotid.
+ Một số kỹ thuật PCR khác:
Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), revert transtriptase PCR (sao chép ngược) và asymmetric PCR (PCR một chiều). PCR lồng là phản ứng PCR bao bồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm trong gene. Như vậy phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm trong sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm tăng