Bộ Kit Immuno Nitrofuran (AOZ) ELISA là dụng cụ thử nghiệm theo phương
pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh, dùng để phát hiện bán định lượng Nitrofuran (AOZ) trong mẫu Thủy sản, Gà, Mật ong.
Thời gian ủ nhiệt: 30 phút +20phút Thời gian phân tích : 1 giờ
Giới hạn phát hiện: 0.1 ppb Độ nhạy: 0,025ppb Tỷ lệ thu hồi: 85 ± 15% Tỷ lệ phản ứng chéo AOZ... 100% AHD...< 0.01% AMOZ...< 0.01% SEM...< 0.01% 1. THÀNH PHẦN BỘ KIT
- 1x khay Microwell phủ kháng thể (12 thanh tháo rời, mỗi thanh 12 giếng)
- 6 lọ dung dịch chuẩn (1ml/lọ):0ng/ml; 0.025ng/ml; 0.05ng/ml; 0.1ng/ml; 0.2ng/ml; 0.5ng/ml - Dung dịch đệm chiết/rửa (10x, 50ml) - Dung dịch đệm phân tích - Dung dịch cộng hợp (100uL) - Thuốc thử gốc 12ml - Cơ chất 12ml
- Hướng dẫn sử dụng
2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ HÓA CHẤT KHÔNG KÈM THEO
- Máy đọc ELIA có bước sóng : 450nm - Micropipette đa kênh 50 – 200 μL
- Micropipette đơn kênh 50, 100 and 200 μL
- Máy trộn mẫu, ống đong, ống ly tâm, máy ly tâm, - Hóa chất: Ethyl acetate, Hexane, nước cất
3. CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THỬ
- Dung dịch rửa/chiết: pha loãng 10 lần dung dịch rửa với nước cất (1 mL + 9 mL)
- Dung dịch đệm phân tích: pha loãng 10 lần dung dịch với nước cất(1 mL + 9 mL)
- Pha dung dịch cộng hợp Enzyme với dung dịch đệm rửa/chiết(30 uL + 12 mL)
4. CHUẨN BỊ MẪU
- Đồng hóa mẫu 1 phút với tốc độ 10.000v/p - Cân 1g mẫu đã đồng hóa cho vào ống ly tâm
- Nếu mẫu Thủy sản : thêm 4ml nước cất + 0,5ml dd HCL 1M và 100 μL thuốc thử gốc lắc trong 1phút.
- Để ống ly tâm qua đêm (khoảng 16 giờ) trong tủ sấy ở nhiệt độ 37°C
- Thêm 5ml dd đệm phân tích, 0.4ml dd NaOH 1M và 5ml ethyl acetate và lắc 1 phút
- Ly tâm tốc độ 3000v/p thời gian 10 phút
khô ở 50°C bằng khí Nitrogen.
- Hòa tan cặn với 0,8ml hexan lắc đều.
- Thêm 1,6ml dung dịch chiết/rửa và trộn đều 1 phút. - Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000v/p
- Dùng Mcropipette hút 50 μL dd bên dưới đem chuẩn bị phân tích
5. TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA
5.1 Chuẩn bị thuốc thử
- Đem tất cả thuốc thử vệ nhiệt độ phòng (20-25°C) trước khi sử dụng
5.2 Qui trình test
- Hút 50 μL mỗi dung dịch chuẩn cho vào giếng chuẩn - Hút 50 μL dung dịch mẫu thử cho vào giếng mẫu
- Thêm 100 μL Cộng hợp cho vào các giếng trên(giếng mẫu, giếng chuẩn và giếng đối chứng âm)
- Trộn đều và lắc đều hổn hợp
- Ủ ở nhiệt độ phòng (25±2°C) 30 phút
- Đổ sạch dung dịch lỏng ra khỏi giếng và vỗ nhẹ trên giấy thấm đến khi không còn dung dịch
trong giếng.
- Rửa giếng bằng dung dịch rửa (khoảng 250 μL/giếng ), vỗ nhẹ các giếng trên giấy thấm. Lập
lại rửa bằng dung dịch rửa 4 lần
- Thêm 100 μL dung dịch cơ chất vào mỗi giếng - Giử và lắc nhẹ các giềng trộn đều dung dịch
- Thêm 100 μL dung dịch dừng mầu vào mỗi giếng , lắc nhẹ
- Đọc kết quả trên máy đo màu (máy đọc ELISA) trong vòng 5 phút
6. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
- Màu đậm = ít Nitrofuran (AOZ) - Màu nhạt = nhiều Nitrofuran (AOZ)
- So sánh màu hoặc mật độ quang của các giếng mẫu với màu hoặc mật độ quang của
các giếng đối chứng âm và dương. Từ đó xác định được mức độ nhiễm Nitrofuran
(AMOZ) trong mẫu.
- Hoặc chính xác hơn ta vẽ đồ thị đường chuẩn của Nitrofuran (AOZ) và dựa vào đó định
lượng mức độ nhiễm của mẫu - Tính toán theo công thức sau :
Trong đó :
- Ao : mật độ quang tại giếng đối chứng âm (không có Nitrofuran (AOZ)) - Ax: mật độ quang tại giếng chuẩn hoặc mẫu
7. BẢO QUẢN
- Bảo quản tại 2 – 8oC. KHÔNG ĐƯỢC ĐỂ _ĐÔNG ĐÁ. Đông đá sẽ làm ảnh
hưởng hoạt tính enzyme.
8. LƯU Ý AN TOÀN
- Các thuốc thử cần ở nhiệt độ phòng khi tiến hành thí nghiệm, sau đó cần cho trở lại ngay vào tủ lạnh, không nên để bên ngoài quá lâu. Riêng đối với cộng hợp enzyme chỉ nên lấy ra 1 lượng vừa đủ dùng không nên để toàn bộ cộng hợp enzyme ra nhiệt độ phòng.
- Trộn đều cộng hợp một cách nhẹ nhàng, tránh tạo bọt. - Không để các hoá chất tiếp xúc ánh nắng.
- Phải cận thận, luôn mang găng tay, áo blu . Dụng cụ sau khi dùng phải làm vệ sinh sạch sẽ, rửa bằng nước Javen 5%
- Không dùng bộ kit khi đã quá hạn.
- Sử dụng pipette đúng sẽ giúp có kết quả đúng
- Khi cho cộng hợp vào giếng phải cho thật nhanh để thời gian cộng hợp ở trong giếng là gần như bằng nhau giữa các giếng. Nếu không kết quả sẽ lệch
* Chú ý: Bộ kit Immuno Nitrofuran (AOZ) giúp sàng lọc nhanh các mẫu có nồng độ nhiễm. Đối với các mẫu dương tính phải kiểm tra lại bằng các phương
pháp định lượng chính xác hơn như HPLC, GC/MS để xác định chính xác độ nhiễm Nitrofuran (AOZ).