Phương pháp chỉ thị phân tử - ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC XA- 123docz.net

2. 2. 2. 1. Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA Thu thập mẫu

 Thu thập mẫu lá tươi, tốt nhất khi lá còn non.

 Đông khô mẫu lá tươi dùng l u dài.

Tách chiết DNA

Sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo CTAB cải tiến (protocol của Phòng Thí nghiệm Di truyền học Trường Đại học Tổng hợp hent, Vương Quốc Bỉ).

1. Thu 2-5 gam lá, Tốt nhất là lá non, lá non sẽ cho ta lượng DNA nhiều nhất. Lá không bị nấm, vi khuẩn, virus. Dùng tươi hoặc đông khô.

2. Cắt lá thành từng đoạn 3mm – 5mm vào ống eppendoft 2ml, lượng lá khoảng 2/3 ống. Mỗi ống cho vào 1 viên bi sắt chuyên dụng, đậy nắp lại.

3. Cho eppendoft chứa lá vào nitơ lỏng ( sau khi đã ng m dụng cụ đựng eppendoft vào nitơ lỏng), khi đủ độ lạnh lấy dụng cụ và eppendoft chứa mẫu ra. Lắp vào máy nghiền 2 phút, nếu chưa mịn ta cho thêm 1 chu k 2 phút nữa.

4. Cho thêm vào mỗi eppendoft 1ml Extraction buffer (EB) đã được đun cách thủy 650C trước đó 20 phút, trộn đều, cắm trong nước đá. Thêm vào mỗi eppendoft 50 µl .D. 10% (lượng S.D.S cho vào theo tỉ lệ 50µl/ml W/v). Ủ trong máy lắc nước thời gian 30 phút ở nhiệt độ 650C.

Chú ý trước khi cho dịch EB vào eppendoft ta cho thêm β- Mecaptoethanol 0,2% theo tỷ lệ 7µl BME/10ml EB, trộn đều. Trong quá trình ủ ở 650C, cứ 5 phút ta lại đảo bằng tay một lần.

5. Ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 40C, tốc độ 13.500 vòng/phút trong 20 phút.

6. Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang 1 ống eppendoft 2ml khác mới (ghi lại số của mẫu). Thêm 1ml isopropanol (đã giữ ở tủ lạnh – 200C), đảo bằng tay một cách nhẹ nhàng trong 5 phút. Rồi để vào tủ lạnh 40C trong 30 phút hoặc qua đêm.

7. Ly tâm lạnh 40C tốc độ 13.500 vòng/phút trong 15 phút.

8. Đổ hết dịch nổi phía trên chỉ giữ lại tủa ở dưới đáy eppendoft để khô tự nhiên, thêm vào 400µl TE 8.0 (10:0.1). Cho vào ủ ở 650C trong 5 phút. Lấy ra búng cho tan tủa hoặc dùng pipetteman 200 hoặc 20 để hòa tan tủa (có thể để tan tự nhiên qua đêm ở nhiệt độ 4 0C) 9. Cho 3µl RNase (10mg/1ml) vào mỗi ống, trộn đều eppendoft bằng tay. Ly tâm cho lắng xuống khi tốc độ đạt 2000 vòng thì dừng lại. Ủ ở 370C trong 6 giờ, sau đó cho vào giữ ở 4 0C (có thể ủ qua đêm) cho tới khi làm tiếp bước 10.

10. Thêm vào mỗi eppendoft 400µl đệm CTAB và ủ trong bình cách thủy 650C, trong 15 phút. Thỉnh thoảng đảo trộn đều bằng tay.

11. Cho vào tủ hood, cho thêm 800µl Choloroform: isomylalcohol (24:1) vào mỗi eppendoft, lắc trộn bằng tay từ 5-7 phút.

12. Ly tâm ở 13.500 vòng/phút trong 10 phút.

13. Dùng pipetteman hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang ống eppendoft mới (ghi lại số ống).

14. Lặp lại bước 11. 15. Lặp lại bước 12. 16. Lặp lại bước 13.

17. Thêm 1400 µl ethanol 96% (đã làm lạnh) và giữ trong tủ lạnh – 200C qua đêm. 18. Ly tâm 13.500 vòng/phút ở 4 0C trong 30 phút, loại bỏ cồn giữ lại kết tủa ở dưới

19. Rửa tiếp bằng 400 µlethanol 70% (đã làm lạnh) ly tâm 13.500 vòng/phút trong 5 phút ở 4 0C. au đó đổ ethanol giữ tủa lại.

20. (Lặp lại bước 19).

21. Đổ ethanol giữ tủa lại để khô tự nhiên hoặc cho vào máy ly tâm khô chân không khoảng 10 phút để làm khô DNA.

22. Cho thêm vào mỗi eppendoft 50µl TE (10 0,1) để hòa tan DNA.

23. Giữ DNA trong tủ lạnh – 200C, dùng dần. Chuẩn bị dung dịch đệm và hóa chất.

2. 2. 2. 2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA

* Đệm CTAB (EB) 500ml

+ CTAB 2% 10 gam CTAB

+ EDTA(pH:8) 0,5M 50ml

+ NACL 2M 200ml 5M

+ Tris. Cl (pH = 7.5) 0,2M 100ml 1M(pH= 7,5)

+ H2O khử trùng 2 lần thêm vào cho đủ tổng số 500ml

Bảng 2-1: Bảng hoá chất *isopropanol (2-Propanol) * SDS 10% *β-Mercaptoethanol : 0,2% * TE pH 8 (10:0,1) + 600µl Tris.HCL 1M pH = 8 + 12µl EDTA 0,5M pH = 8

+ Thêm dH2O cho đủ V = 60ml. * RNase – 10mg Nase/10ml H2O đun sôi 10-15 phút, giữ trong -200C.

* Hỗn hợp Chloroform: isoamylalcohol (24:1). * Ethanol tuyệt đối và ethanol 70% giữ ở - 200C.

2. 2. 2. 3. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR)

Kỹ thuật này được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Khoa thực vật và Thổ nhưỡng, thuộc trường ĐH Công nghệ Texas, ở Hòa K . Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR

 Để làm phản ứng, Pha DN khuôn (template) của các mẫu đồng nhất 30ng/lµl.

 Kiểm tra mồi để làm phản ứng, với các mồi còn tốt chỉ dùng 0,32µl (10µM/µl) cho một phản ứng (tổng số 20µl).

 Trình tự primer ITS.

ITS 1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-

 Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: Thành phần Thứ tự thêm Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng

vào

Nước cất 2 lần đã khử ion, khử trùng 5xPCR Buffer (với dNTP, mỗi loại 10µl + 10µl BSA +450 µl dH2O)

MgCl2

Mồi thuận (10µM) Mồi nghịch (10µM) TaqDNA polymerase (5units/µl)

ADN khuôn (30ng/µl) 1 2 3 4 5 6 7 X 4 0,64 Y 0,3 3 * 1x(dNTP = 200µl) 15mM 0,2µM 0,2µM 1.5 Units ≈90ng/20µl Tổng thể tích 20µl Bảng 2-2: Thành phần và thứ tự phản ứng PCR

 Sau khi làm xong phản ứng ta ly t m 2000v/phút, cho mẫu lắng xuống bằng máy ly t m c n bằng. Khi tốc độ đạt 2000v/phút ta lấy ra.

 Tiến hành phản ứng PCR.

Mỗi phản ứng PCR chúng tôi thường chạy 30 chu kỳ . Chường trình chạy phụ thuộc nhiệt độ ủ (annealing) của mồi . Thường nhiệt độ ủ là 550 , ta có chương trình cài đặt như sau:.

(Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011)

Các bước Nhiệt độ(℃) Thời gian Số chu kỳ

I 940 950 5’ 1:30” 1 II 550 720 1:30” 1:30” 30 III 720 5 1

IV 40 Cho đến khi lấy ra

Bảng 2-3: Chương trình cài đặt các bước.

Trường hợp nhiệt độ ủ là 600C hay 630C ta chỉ thay đổi nhiệt độ ủ 550C ở bước II thành 600C hay 630C.

2. 2. 2. 4. Phương pháp xử lý số liệu

Phân tích phân ly di truyền

Các số liệu phân tích phân ly di truyền tính trạng kháng rầy được xử lý thống kê (Gomez and Gomez, 1984) theo phép thử “x2 ”.

X2=

Trong đó: i= 1, 2, …., m m là số lớp phân ly

Qi là tần số quan sát thực tế của lớp i Li là tần số xuất hiện lý thuyết của lớp i

Từ giá trị « X2 tìm được , tra bảng thống kê để tìm giá trị P tương ứng. Nếu P>0,05 thì tỉ lệ phân ly thực nghiệm được coi là phù hợp với lý thuyết.

Tương dồng di truyền và khoảng cách di truyền

Phân tích mức tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền theo chương trình PopGene, theo công thức của Nei (1972) [146] :

I= và D = - ln (I)

Trong đó : I – mức tương đồng di truyền D – khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu q12 – số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu

Q1 và Q2 tổng số các alen của mẫu 1 và mẫu 2. Phân tích liên kết

Phân tích liên kết các chỉ thị phân tử với locut gen kháng rầy nâu và định vị các locut gen kháng rầy nâu trên nhiễm sắc thể của lúa được tiến hành theo chương trình máy tính MapMarker.

Phân tích liên kết

2. 2. 2. 5. Giải trình tự DNA và xác định gen ITS

Kỹ thuật này dựa trên phương pháp Sanger ( Sanger er al.,1977). Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất hu nh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy các oligonucleotid cuùng chấm dứt tại một dideoxxynucleotid sẽ có cùng một màu. DNA được giải trình tự bởi công ty DNA Sequencing ServicesGeneral Order Information, Hàn Quốc trên máy đọc trình tự tự động.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết

-Phương pháp thu thập thông tin, ph n tích, so sánh, tổng hợp. - Phân loại thông tin nghiên cứu.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu tài liệu

- Nội dung cần thu thập trong quá trình nghiên cứu tài liệu.

- Nguồn tài liệu các Bài báo, Hội thảo khoa học, giáo trình Hóa sinh, các -Luận văn và Luận án khoa học liên quan đến cây Rau Húng, các trang Web liên quan.

- Phân tích tài liệu. -Tổng hợp tài liệu.

2.4. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

- Các thông tin được thu thập phải đảm bảo chính xác, có độ tin cậy cao nhất.. - Kết quả của nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh và - Sản xuất của các cơ quan nghiên cứu

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI 3.1.Mẫu cây rau húng được thu thập tại Tiền Giang ở vị trí:

- Kinh độ: …. - Vĩ độ: …… Passifloraedulis Loài (species):… Chi (genus): … Họ (familia): …. Bộ (ordo):… Lớp: Giới (regnum): Tên khác: 3. 1.1. Thân. 3. 1. 2. Lá 3. 1. 3. Rễ 3. 1. 4. Hoa 3.1.5. Quả 3. 1. 6. Hạt Hình 3. . Tọa độ địa lý

3. 2. HOÀN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 3.2.1. Quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA rút gọn

3.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR rút gọn

3.2.2.1. Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR

3.2.2.2. Thành phần và thứ tự phản ứng PCR: 3.2.2.3. Tiến hành phản ứng PCR.

3.2.2.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA

3. 3. KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP 3.3.1. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA

3.3.2. Kết quả giải trình tự gen DNA

3.3.3. Kết quả phân tích độ tương đồng trên NCBI

3. 4. MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY ………

3. 4. 1. 3.4.1.1. 3.4.1.2. 3. 4. 1.3. ……… ……… ……….. 3. 4. 2. 3. 4. 2. 1. 3. 4. 2. 2. 3. 4. 2. 3. ……… ……… ……… ………

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 4.1. KẾT LUẬN.

Quá trình nghiên cứu, tổng hợp tài liệu qua các báo cáo khoa học của đã khẳng định.

4.1.1.Mẫu cây rau húng được thu thập tại Tiền Giang ở vị trí:

- Kinh độ: - Vĩ độ: Tên khoa học: Loài (species): Chi (genus): Họ (familia): Lớp:

Giới (regnum): Plantae.

Tên khác:

4.1.2.Đặc điểm chỉ thị hình thái thu được phù hợp với cây ……..mô tả trong đề tài. Thân Lá Rễ Hoa Quả Hạt Kết luận:

4.1.3. Hoàn thiện quy trình chiết xuất và tinh sạch DNA và chu kỳ PCR cây rau húng.

- -

4.1.4. Kết quả chiết xuất và tinh sạch DNA cây rau húng và trình tự gen của cây này.

- - - 4.2. KIẾN NGHỊ - -

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

2. Bộ Y Tế, 2009. Dược điển Việt Nam V. Nhà xuất bản Y học. Tr. 590 3. Cổng thông tin điện tử của Bộ Y tế (MOH).

4. Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam

5. Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001. Thực vật cấp cao. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM, Tr. 45-61, Tr. 183-193.

6. Dược Thư Quốc Gia. 2002-2009. Tr 3081-3087.

Tài liệu nước ngoài

1. Adnyana, I.K., F. Setiawan and M. Insanu, 2013. From ethnopharmacology to clinical study of Orthosiphon stamineus Benth. Int. J. Pharm. Pharmaceut Sci., 5: 66-73.

2. Akowuah, G.A., Z. Ismail, I. Norhayati and A. Sadikun, 2005. The effects of different extraction solvents of varying polarities on polyphenols of Orthosiphon stamineus and evaluation of the free radical-scavenging activity. Food Chem., 93: 311-317

Wedsite

1. Https://Duoclieu.vn truy cập ngày 28 tháng 9 năm 2021

2. Http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/109 truy cập ngày 28 tháng 9 năm 2021

3. http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/73truy cập ngày 1 tháng 10 năm 2021

4. https://www.ydhvn.com/news/cay-duoc-lieu-cay-bac-ha-hay-bac-ha-nam-mentha- arvensis. Truy cập ngày 1 tháng 10 năm 2021

PHỤ LỤC Phụ lục A.

Phụ lục B: Quytrìnhlytrích DNA Tách chiết DNA:

- Nghiền 200l mẫu trong túp eppendorf bằng máy nghiền. - Thêm 1ml dung dịch trích (EB) và 50l SDS (10%). - Ủ 65 trong 30’ (5’ đảo nhẹ)

- Li tâm 13.000rpm trong 10’.

- Chuyển phần trong (800l) vào túp mới và thêm một lượng tương đương Isopropanol, ủ 2 giờ ở -20oC.

- Li tâm 13.000rpm trong 10’, hoà tan DNA trong 400 l TE. - Thêm 10l Rnase (10mg/ml) ủ ở 37 trong 15’.

- Thêm 400l CTAB buffer và ủ ở 65 trong 15’, thỉnh thoảng đảo ngược ống túp để trộn đều.

- Thêm 800l Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) và trộn đều.Litâm 13.000rpm trong 5’. - Chuyển phần dung dịch trong qua túp 2.2 ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 15’.

- Li tâm 13.000rpm trong 10’, đổ bỏ phần trong và rửa phần cặn với ethanol 70% bằng 700l.Li tâm lần nữa để loại bỏ ethanol.

- Để vào máy li tâm chân không 45 trong 10’. - Hoà tan DNA trong 200l TE 0.1.

(Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT. Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011)

Phản ứng PCR

Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau:

ITS 1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4: 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’

Quá trình thực hiện phản ứng PCR:

Hóa chất Thể tích (µl)

H20 34,5

PCR buffer (10X Taq buffer

(NH4)2SO4) 5

Polymerisation MgCl2 (25mM) 3

dNTPS 3

Primer F 1

Primer R 1

Taq DNA polymerase (5u/µL) 0,5

DNA 2 Tổng cộng 50 Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 Biến tính 30 9595 5 phút60 giây

2 Bắt cặp 30 54 50 giây

3 Kéo dài 30 7272 90 giây5 giây

Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự bằng hệ thống giải trình tự tự động. Kết quả này sẽ được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank trên trang web NCBI bằng công cụ BLASTN.

XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

TP. Cần Thơ, ngày… tháng… năm 202..

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

TS. THIỀU VĂN ĐƯỜNG

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM 1 Họ và Tên:… Nhận xét: ……… ……… ……… ……… ………. KÝ TÊN ĐIỂM

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM 2 Họ và Tên:………..……….. Nhận xét: ……… ……… ……… ……… ………. KÝ TÊN ĐIỂM