CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. 2.1 Tách chiết tổng số và tinh sạch DNA
ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến (Doyle and Doyle, 1990).
Cân 100 mg mẫu lá cây cho vào cối và tiến hành nghiền mịn trong 1 mL dung dịch CTAB 2X đã được ủ ở 65 oC trong 15 phút. Cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL vào mẫu đã được nghiền. Trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Sau khi ly tâm xong, hút lần lượt mỗi tuýp 1000 μL lớp dịch trong bên trên và cho vào tuýp mới. Sau đó thêm vào 10 μL β-mercaptoetha- nol/tuýp. Tiến hành ủ ở nhiệt độ 65 oC trong 60 phút (mỗi 10 phút trộn đều mẫu 1 lần). Tiếp theo cho thêm vào mỗi tuýp 500 μL chloroform, trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Hút 750 μL phần dung dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó tiếp tục thêm vào 500 μL chloroform, trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Chuyển 550 μL dung dịch bên trên và cho vào tuýp mới, sau đó thêm 500 μL chloroform vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Rút 350 μL lớp dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó thêm 5 μL RNase vào mỗi tuýp, lắc đều và ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 μL CTAB 2X và 500 μL chloroform vào mỗi tuýp. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Tiếp theo rút mỗi tuýp 400 μL lớp dịch bên trên và cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 μL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ -20 oC trong 30 phút. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong phút, phần kết tủa lắng tụ bên dưới được thêm 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Thêm tiếp tục 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút. Sau đó đổ bỏ phần cồn phơi khô mẫu dưới quạt trần trong 1 giờ. Cuối cùng thêm vào mỗi tuýp 30 μL TE (pH = 8.0) để hòa tan ADN và trữ lạnh ở nhiệt độ -20 oC.Rút 350 μL lớp dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó thêm 5 μL RNase vào mỗi tuýp, lắc đều và ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 μL CTAB 2X và 500 μL chloroform vào mỗi tuýp. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Tiếp theo rút mỗi tuýp 400 μL lớp dịch bên trên và cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 μL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ -20 oC trong 30 phút. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong phút, phần kết tủa lắng tụ bên dưới được thêm 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Thêm tiếp tục 500 μL ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút. Sau đó đổ bỏ phần cồn phơi khô mẫu dưới quạt trần trong 1 giờ. Cuối cùng thêm vào
2. 2. 2. 2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA
*Phương pháp tinh sạch ADN
Để tinh sạch ADN, sử dụng kit tinh sạch của hãng Fermentas (Đức) gồm các bước tiến hành như sau:
1. Lấy 100 μL đệm tách ADN, cùng với 100μL ADN rồi trộn đều.
2. Chuyển lên cột Genne JetTm. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch bên dưới
3. Thêm 700 μL đệm rửa để loại tạp chất. Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ phần dịch bên dưới.
4. Đặt cột vào trong ống 1,5 μL. Cho 30μL H2O vào cột sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 2 phút.
5. Bảo quản ADN ở -20 đến -80 o C.
2. 2. 2. 3. Kỹ thuật phân tích DNA bằng chỉ thị vi vệ tinh (SSR)
Chỉ thị ví vệ tỉnh là những đoạn DNA lập lại gồm những đơn vị lặp lại từ 2 đến 6 nucleotid, theo kiểu lặp lại ngắn một cách có trật tự. Chỉ thị này đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga - 1982; Weber và ctv - 1989). Hiện nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của rất nhiều sinh vật bậc cao khác như một số loài cây một lá mầm và hai lá mầm (Morgante và ctv -1993; Wang và ctv - 1994): một số gia cầm, động vật có vú (Cheng và ctv - 1994; Love và ctv - 1990; Moran và ctv - 993: Serikawa và ctv - 1992); cá (Estuop và ctv -1993).
Sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại, có thể sinh ra đa hình SSR. Giá trị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, đễ dàng phát hiện bằng PCR. Các chỉ thị SSR đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật ( Bell và Ecker - 1994; Tautz và Renz - 1984). Ở người, SSR được xem là thẻ hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử.Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên các cây rừng nhiệt đới (Condit và Hubell -1991).bắp cải (Lagercrantz và ctv - 1993), lúa mì (Roder và ctv - 1995), và 34 giống cây trồng khác (Morgante và Olivieri - 1993). Những kết quả nghiền cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật thì SSR mang trình tự lặp lại (AT)n, nhiều hơn, còn ở động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n , hơn. Những nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley - 1993), ngô (Senio và Heun - 1993) và Arabidopsis (Bell và Ecker - 1994) cũng cho kết quả tương tự. Trong các nghiên cứu thư viện hệ trên lúa, sau khi sàng lọc (screening) cho thấy có khoảng 5.700- 10.000 vi vệ tinh ở lúa (McCouch và ctv - 1997).
Hạn chế lớn nhất của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém, đồng thời mỗi một lô riêng biệt chỉ đặc trưng bởi một loại mới.
2. 2. 2. 4. Phương pháp xử lý số liệu
- Thu thập và xử lí các số liệu theo phương pháp thống kê - Phân tích xử lí các số liệu bằng phần mềm Excel.
Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm Gel Analyzer. Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản cập nhật mới nhất 7.0.5 (Hall, 1999). Sau đó sử dụng phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gene NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). dùng cho việc nhận diện loài.