Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình cầu. Chiết hồi lưu với 20ml methanol 80 % trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 850C. Lọc thu lấy dịch chiết, thêm tiếp 20ml methanol và tiến hành chiết lần 2. Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 50ml và bổ sung tới vạch định mức bằng methanol 80%, lắc đều thu được dung dịch thử.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5mg quercetin chuẩn (độ tinh khiết 98%) vào bình định mức 25ml và định mức bằng methanol 80% ta thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 196µg/ml.
Tiến hành định lượng:
Hút chính xác 2 ml dịch chiết vào bình định mức 10ml, thêm 0,2ml dung dịch nhôm clorid (10% kl/tt), 0,4ml dung dịch natri acetat 0,5M và định mức tới 10,0ml bằng methanol. Hỗn hợp phản ứng để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ tại bước sóng khảo sát. Giá trị A ghi nhận và tiến hành xây dựng đường tuyến tính để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết dược liệu.
Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dược liệu được tính theo công thức: X = 𝐶 𝑥 10−3𝑥 𝑉 𝑥 𝐾
𝑀𝑑𝑙 𝑥 (100−𝑎)𝑥 10−2 (𝑚𝑔 𝑄𝐸/g dược liệu)
Trong đó:
X: Hàm lượng flavonoid toàn phần của mẫu thử (mg QE/g dược liệu) C: Nồng độ dung dịch đo quang của mẫu thử (µg/ml)
V: Thể tích dung dịch chiết gốc (50 ml) K: Hệ số pha loãng Mdl : Khối lượng dược liệu (g) a: Độ ẩm dược liệu (%)
2.3.3.4. Triển khai sắc ký lớp mỏng các phân đoạn dịch chiết 2 loài Lysimachia baviensis
và Lysimachia laxa
Với mục đích sơ bộ khảo sát thành phần hóa học 2 loài nghiên cứu để làm căn cứ cho các nghiên cứu tiếp theo về hóa thực vật của 2 loài, chúng tôi tiến hành chiết xuất dịch chiết methanol toàn phần cũng như các phân đoạn dịch chiết 2 loài nghiên cứu sử dụng n-hexan và ethyl acetat.
19
Chuẩn bị dịch chiết: Cân 1g bột dược liệu thô mỗi loài, chiết hồi lưu với methanol 80%, chiết 2 lần, mỗi lần làm với 25 ml methanol 80 % trong 1 giờ. Gộp dịch chiết, để nguội, gạn lấy dịch chiết và cất thu hồi dung môi đến cắn. Phân tán cắn trong 10 ml nước, rồi lắc với n-hexan 5 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp và thu lấy phân đoạn n-hexan, tiếp tục lắc lớp nước với ethyl acetat 5 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp và thu lấy phân đoạn ethyl acetat, cất thu hồi dung môi đến cắn. Gộp và thu lấy phân đoạn còn lại (phân đoạn nước). 3 phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và phân đoạn nước được thu hôi dung môi đến cắn. Hòa tan cắn mỗi phân đoạn thu được trong 1ml methanol, được dung dịch thử 3 phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và phân đoạn nước.
Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck, Đức). Trước khi chấm, bản mỏng được hoạt hóa 110oC trong 1 giờ.
Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi pha động phù hợp với từng phân đoạn dịch chiết, lựa chọn hệ dung môi cho kết quả tách tốt nhất.
Chấm sắc ký: Chấm 20µl dịch chiết loài L. baviensis, 20µl dịch chiết L.laxa từng phân đoạn lên cùng bản mỏng sử dụng hệ thống chấm sắc ký Linomat V, để khô tự nhiên.
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín, để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 1 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự nhiên trong tủ hốt.
Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm, 366nm. Sau đó phun thuốc thử rồi soi, chụp ảnh ở bước sóng 366nm. Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết được phân tích số lượng, vị trí các vết sử dụng phần mềm visionCATs
20
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học mẫu nghiên
cứu
3.1.1.Đặc điểm thực vật loài Lysimachia baviensis
Đặc điểm hình thái: Cây thảo nhiều năm, không lông, cao 25-30 cm. Lá mọc đối, phiến lá hình trứng hay trứng rộng tới hình tròn, dài 10-15 cm, rộng 8-12 cm, đáy hình tim hoặc bất xứng, gân bên 5-7 cặp, cuống dài 3-5 cm. Hoa mọc chùm ở đầu cành hay ở nách lá trên cuống dài đến 4-6 cm, mỗi chùm khoảng 5-9 hoa, hoa màu vàng tươi, cao 1-2,5 cm, tiêu nhụy, bầu có lông rải rác, chỉ nhị rất ngắn, bao phấn hình mũi mác, màu trắng hoặc tím nhạt.
Hình 3.1 Ảnh chụp đặc điểm thực vật loài Lysimachia baviensis C.M.Hu
1. Dạng sống; 2. Chùm hoa; 3. Hoa; 4. Nụ; 5. Đài hoa; 6. Tràng hoa; 7. Bầu; 8. Nhị hoa.
So sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Thực vật chí Campuchia, Việt Nam, Lào (Flore du cambodge du Laos et du Viêtnam) [4], [15],
21
[41], đồng thời tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật, nhóm nghiên cứu xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Lysimachia baviensis C.M.Hu.
3.1.2.Đặc điểm thực vật Lysimachia laxa
Đặc điểm hình thái: Cây thảo mọc hàng năm. Thân cao 40-60 cm, mọc đứng, có góc, thường phân nhánh. Lá mọc so le, phân bố đều dọc thân cây; phiến không lông, mỏng, hình bầu dục-mũi mác, dài 4-11 cm, rộng 0,5-2,5 cm, thon nhọn 2 đầu, hình nêm và men theo ở gốc, nhọn mũi nhiều hay ít, dạng màng, mặt trên có lông tơ rải rác, mặt dưới không lông, có điểm tuyến màu nâu, gân bên 6 – 8 cặp; cuống lá dài 1-2 cm. Hoa đơn độc ở nách lá. Cuống mảnh như chỉ, dài 2,5 cm. Đài chia thùy hình trứng bầu dục, có tuyến. Tràng màu vàng, cao gấp đôi đài, chia sâu thành thùy hình trứng ngược – bầu dục. Nhị có chỉ nhị chỉ nhị gắn trên vòng tràng hàn liền. Quả nang tròn, đường kính 5 – 6mm, mang vòi tồn tại, mở bởi khe dài tới gốc.
Hình 3.2 Ảnh chụp đặc điểm thực vật loài Lysimachia laxa Baudo
So sánh đặc điểm hình thái thực vật, đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Thực vật chí Campuchia, Việt Nam, Lào (Flore du cambodge du Laos et du Viêtnam) đồng thời
22
tham khảo ý kiến của các chuyên gia về phân loại thực vật, nhóm nghiên cứu xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Lysimachia laxa Baudo.
3.2.Kết quả nghiên cứu đặc điểm hiển vi 2 loài Lysimachia baviensis C.M.Hu và
Lysimachia laxa Baudo
3.2.1.Đặc điểm giải phẫu (thân, lá) 2 loài nghiên cứu
Lysimachia baviensis C.M.Hu
Vi phẫu thân (Hình 3-1)
Mặt cắt hình bầu dục, có những mấu lồi. Từ ngoài vào trong có: Lớp biểu bì gồm một hàng tế bào nhỏ, sắp xếp đều đặn (1), dưới lớp biểu bì tế bào mô dày hình đa giác, tập chung nhiều hơn ở chỗ lồi của thân cây, có thành dày lên ở góc (2). Mô mềm vỏ gồm các tế bào hình đa giác, thành mỏng, kích thước không đồng đều, sắp xếp lộn xộn (3). Libe gồm các tế bào đa giác, kích thước nhỏ, xếp thành vòng liên tục bao quanh gỗ (4), gỗ tập trung thành các vòng liên tục (5). Trong cùng là mô mềm ruột gồm các tế bào đa giác kích thước lớn hơn so với mô mềm vỏ, thành mỏng (6).
Hình 3.3 Ảnh vi phẫu thân Lysimachia baviensis C.M.Hu
1. Biểu bì; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4.Libe; 5.Gỗ; 6. Mô mềm ruột. Vi phẫu lá:
Phần gân lá: mặt lá trên hơi lõm, mặt dưới lồi. Biểu bì trên gồm 1 hàng tế bào lớn, không đồng đều, xếp sát nhau (1). Dưới lớp biểu bì là mô mềm, gồm các tế bào
23
thành mỏng hình đa giác, sắp xếp lộn xộn (2). Bó libe-gỗ ở gân chính tạo thành hình vòng cung hướng lên trên, bó ở giữa to nhất. Các bó gỗ xếp thành vòng không liên tục, hướng lên trên (4). Cung libe bao phía ngoài bó gỗ (3). Ngoài ra có thể quan sát thấy bó libe - gỗ phụ nằm gần bó libe gỗ chính. Sát lớp biểu bì dưới là 1-2 hàng tế bào mô dày, hình đa giác, có thành dày lên ở các góc (6). Biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào nhỏ (1). Trên bề mặt biểu bì có thể quan sát thấy các lông tiết, chân 1-3 tế bào (7).
Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào nhỏ, xếp không đều (9), giữa là mô khuyết, gồm các tế bào thành mỏng, kích thước không đồng đều, để hở những khoảng trống (8).
Hình 3.4 Ảnh vi phẫu lá Lysimachia baviensis C.M.Hu
1.Biểu bì dưới; 2. Mô mềm; 3. Libe; 4. Gỗ; 5. Biểu bì trên; 6. Mô dày; 7. Lông tiết; 8. Mô khuyết; 9. Biểu bì phiến lá.
Lysimachia laxa Baudo
Vi phẫu thân
Mặt cắt hình tròn hoặc bầu dục. Từ ngoài vào trong có: Lớp biểu bì gồm một hàng tế bào nhỏ, hình đa giác, không đều nhau, màng ngoài có một lớp cutin mỏng bao bọc (1) Sát lớp biểu bì là 1-2 hàng tế bào mô dày (2). Mô mềm vỏ gồm các tế bào thành uốn lượn, hơi bị ép bẹt, kích thước không đồng đều, sắp xếp lộn xộn (3). Các tế bào mô
24
cứng nằm riêng lẻ ở nội bì, sát lớp libe (4). Libe gồm các tế bào đa giác, kích thước nhỏ, xếp thành vòng liên tục bao phía ngoài gỗ (5), gỗ tập trung thành các vòng tròn liên tục đồng tâm (6). Trong cùng là mô mềm ruột chiếm phần lớn tiết diện vi phẫu, gồm các tế bào đa giác, kích thước lớn, thành mỏng, các góc có khoảng gian bào nhỏ (7).
Hình 3.5 Ảnh vi phẫu thân loài Lysimachia laxa
1.Biểu bì; 2. Mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Mô cứng; 5. Libe; 6. Gỗ; 7. Mô mềm ruột. Vi phẫu lá
Phần gân lá: mặt trên hơi lõm, mặt dưới lồi. Biểu bì trên 1 hàng tế bào hình chữ nhật kích thước đồng đều, xếp sát nhau (7). Dưới lớp biểu bì là mô mềm, gồm các tế bào thành mỏng hình đa giác, sắp xếp lộn xộn (3). Trong mô mềm ở phiến lá, có bó libe gỗ phụ (6). Cung libe - gỗ nằm ở giữa gân chính. Cung gỗ gồm các bó gỗ xếp thành từng dãy, nằm phía trong, hướng lên trên (5). Cung libe bao phía ngoài cung gỗ (4). Nằm sát lớp biểu bì dưới là 1-2 hàng tế bào mô dày, dày lên ở góc (2). Biểu bì dưới là các tế bào hình tròn nhỏ, kích thước đồng đều, xếp đều nhau (1).
Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm 1 hàng tế bào kích thước không đồng đều, xếp sát nhau. Ở giữa là mô mềm khuyết, gồm các tế bào thành mỏng, kích thước không đồng đều.
25
Hình 3.6 Ảnh vi phẫu lá Lysimachia laxa
1.Biểu bì dưới; 2. Mô dày; 3. Mô mềm; 4. Libe; 5. Gỗ; 6. Bó libe – gỗ phụ; 7. Biểu bì trên
3.2.2.Đặc điểm bột dược liệu 2 loài nghiên cứu
Lysimachia baviensis C.M.Hu
Bột màu nâu, mùi hắc, vị nhạt. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì thân (1), mảnh cánh hoa màu vàng với các tế bào sắp xếp khá đều đặn (2), Rải rác có các lỗ khí (3). Hạt phấn hoa hình cầu, đứng riêng lẻ, không phân biệt mặt phẳng cực và mặt phẳng xích đạo, kích thước nhỏ (khoảng 20 µm), không có rãnh, lỗ, bề mặt nhẵn (4). Rải rác có các hạt tinh bột (5), mảnh mô mềm thân tế bào hình đa giác (6), sợi dài (7), mảnh mạch vòng (8), mảnh mang màu (9).
26
Hình 3.7 Một số đặc điểm bột loài Lysimachia baviensis C.M.Hu 1. Mảnh biểu bì thân, 2. Mảnh cánh hoa, 3. Lỗ khí, 4. Hạt phấn,
5. Hạt tinh bột, 6. Mảnh mô mềm thân, 7. Sợi, 8. Mảnh mạch vòng, 9. Mảnh mang màu
Lysimachia laxa Baudo
Bột màu nâu, mùi hắc, vị nhạt. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì hình đa giác xếp sát nhau, mang lỗ khí (1), lỗ khí đứng riêng lẻ (2), mảnh mô mềm phiến lá (3). Mảnh mô mềm (4), đôi khi mang rất nhiều hạt tinh bột (5), đôi khi quan sát thấy mảnh mô mềm mang các bó sợi và mạch gỗ (6), tế bào cứng (7), rải rác có các mảnh mạch xoắn (8) và tinh thế canxi oxalat (9).
27
Hình 3.8 Một số đặc điểm bột loài Lysimachia laxa Baudo
1. Mảnh biểu bì mang lỗ khí, 2. Lỗ khí, 3. Mảnh mô mềm phiến lá, 4. Mảnh mô mềm, 5. Mảnh mô mềm mang tinh bột, 6. Bó sợi, 7. Tế bào cứng,
8. Mạch xoắn,9. Tinh thể canxi oxalat
3.3.Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa
học
Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong 2 loài nghiên cứu
STT Nhóm chất Phản ứng định tính L. baviensis L. laxa
Kết quả Kết luận Kết quả Kết luận 1
Flavonoid
P/ư Cyanidin -
Âm tính + Dương
tính
28
P/ư với dd FeCl3 5% - +
P/ư diazo hóa - +
2 Saponin Quan sát hiện tượng
tạo bọt +++ Dương tính ++ Dương tính 3 Courmarin P/ư mở đóng vòng lacton +++ Dương tính +++ Dương tính Quan sát huỳnh quang + + 4 Tanin
P/ư với FeCl3 5% -
Âm tính
-
Âm tính P/ư với Chì acetat
10% - -
P/ư với gelatin 1% - -
5 Alcaloid
P/ư với TT Mayer -
Âm tính - Âm tính P/ư với TT Bouchardat - - P/ư với TT Dragendorff - -
6 Anthranoid P/ư Borntraeger - Âm tính - Âm tính
7 Đường
khử
P/ư với TT Fehling
A và Fehling B + Dương tính + Dương tính 8 Acid amin P/ư với TT Ninhydrin 3% +++ Dương tính - Âm tính
9 Sterol P/ư Liebermann + Dương
tính + Dương tính 10 Glycosid tim P/ư Liebermann- Burchardt - Âm tính - Âm tính P/ư Baljet - - P/ư Legal - - P/ư Keller-Kiliani - -
Chú thích: (-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính
29
Nhận xét: Từ bảng kết quả trên, sơ bộ kết luận, trong 2 loài nghiên cứu đều có saponin,
courmarin, sterol, đường khử, ngoài ra trong L. baviensis còn có acid amin, L. laxa còn có phản ứng rõ của flavonoid.
3.4.Kết quả định lượng polyphenol toàn phàn trong dịch chiết dược liệu 2 loài
nghiên cứu
Xây dựng đường chuẩn định lượng
Kết quả độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn (Bảng 3.2) và đồ thị tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn (Hình 3.5) như sau:
Bảng 3.2 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn từ G1 đến G5
Dung dịch chuẩn G1 (2µg/ml) G2 (4µg/ml) G3 (6µg/ml) G4 (8µg/ml) G5 (10µg/ml) Độ hấp thụ A trung bình 0,183 0,381 0,543 0,76 0,917
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ acid gallic chuẩn Kết quả định lượng:
Dựa vào phương trình tuyến tính hồi quy y = 0,0923x + 0,0027 (hệ số tương quan R2 = 0,9979 đạt yêu cầu về giới hạn) khoảng xác định từ 2-10 µg/ml
Trong đó: x là nồng độ polyphenol trong dung dịch đo quang y là mật độ quang của dung dịch đo.
y = 0.0923x + 0.0027 R² = 0.9979 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 0 2 4 6 8 10 12 Độ h ấ p th ụ A
30
Bảng 3.3 Kết quả định lượng polyphenol toàn phần trong dược liệu
Loài Khối lượng
cân Mdl (g) Hàm ẩm a (%) Hệ số pha loãng K Mật độ quang A Hàm lượng (mg GAE/g dược liệu) L. baviensis 1,0154 10,5 20 0,294 3,47 L. laxa 1,0175 11 20 0,383 4,55
Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần trong loài L. baviensis là 3,47 mg GAE/g dược liệu, thấp hơn 1 chút so với loài L. laxa là 4,55 mg GAE/g dược liệu.
3.5.Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong 2 loài Lysimachia baviensis và
Lysimachia laxa
Bảng 3.4 Kết quả đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn Q1 đến Q5
Nồng độ quercetin chuẩn 2,94 3,92 5,88 7,35 8,82 Độ hấp thụ A 0,22 0,32 0,455 0,571 0,704
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ quercetin
y = 0.0799x - 0.0081 R² = 0.9971 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 2 4 6 8 10 Độ hấ p thụ A Nồng độ quercetin chuẩn µg/ml Độ hấp thụ A
31
Dựa vào phương trình tuyến tính hồi quy y = 0,0799x - 0,0081 (hệ số tương quan R2 = 0,9971 đạt yêu cầu về giới hạn)
Trong đó: x là nồng độ flavonid trong dung dịch đo quang y là mật độ quang của dung dịch đo.
Bảng 3.5 Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần trong dược liệu 2 mẫu nghiên cứu