2.2.1.1. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [50, 52, 60, 62, 68]
Nguyên tắc của phương pháp là dùng protein casein làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin - Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme.
21
2.2.1.2. Phương pháp định lượng hàm lượng chondroitin sulfate
Định lượng CS bằng phương pháp so mầu theo Farndale và cộng sự [56].
Nguyên lý: dựa trên sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ của DMMB (1,9 Dimethylmethylene) khi tác dụng với chondroitin sulfate ở bước sóng 525nm. Dựa vào đường chuẩn chondroitin sulfate A (gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4) với DMMB để xác định hàm lượng chondroitin sulfate. Phương pháp này có độ nhạy cao, có thể định tính và định lượng hàm lượng CS ở mức μg.
- Chuẩn bị mẫu
+ Pha xanh methylen: cân chính xác 15 mg xanh methylen, hòa tan trong 75 ml nước cất và định mức bằng nước cất đến 100 ml trong bình định mức 100 ml lắc đều trong 5 phút. Sau đó, chuyển 25 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến 100 ml. Thu được dịch xanh methylene có nồng độ 37,5 µg/ml.
+ Chuẩn bị dung dịch CS chuẩn: cân chính xác 100 mg CS chuẩn 92,42%, hòa tan trong nước cất và định mức lên 100 ml. Sau đó, chuyển 5 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml định mức lên 100 ml và lắc đều. Thu được dịch CS chuẩn có nồng độ 50 µg/ml.
+ Chuẩn bị mẫu kiểm tra hàm lượng CS: dịch thu được sau thủy phân, lấy 5ml chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức đến 100ml.
- Cách tiến hành
Chuẩn bị 3 bình định mức 50 ml, gồm mẫu trống, mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra hàm lượng CS. Cho vào mỗi bình 10 ml xanh methylen, thêm 2 ml dịch thủy phân vào mẫu kiểm tra hàm lượng CS, 2 ml dung dịch CS chuẩn vào mẫu chuẩn và mẫu trống là 2 ml nước cất. Sau đó, định mức lên 50 ml, lắc đều trong vòng 30 phút và so mầu ở bước sóng 525nm.
- Tính kết quả: hàm lượng CS được tính như sau: CS = ODb − ODt
ODb − ODst× Gt× P Trong đó:
ODb: Độ hấp thụ của mẫu trống.
22
ODst: Độ hấp thụ của mẫu CS chuẩn. Gt : Khối lượng CS chuẩn sử dụng (mg).
P: Phần trăm độ tinh khiết của CS tiêu chuẩn (92,42%). CS: Lượng CS trong mẫu.
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate và bột đạm * Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate trong quá trình thủy phân: hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate trong quá trình thủy phân (Hc) được tính bằng tỷ lệ phần trăm (%) giữa tổng lượng chondroitin thu được trong dịch thủy phân sụn cá mập so với tổng lượng chondroitin sulfate có trong nguyên liệu sụn cá mập.
HC = mcd
mcn× 100% Trong đó: Hc: hiệu suất thu nhận chondroitin sulfate.
mcd: tổng lượng chondroitin có dịch thủy phân sụn cá mập thu được.
mcn: tổng lượng chondroitin có trong nguyên liệu sụn cá mập dùng trong quá trình thủy phân.
* Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfatetrong quá trình sấy phun: hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate trong quá trình sấy phun (Hcsấy) được tính bằng tỷ lệ phần trăm (%) giữa tổng lượng chondroitin có trong bột đạm thu được sau sấy so với tổng lượng chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân sụn cá mập.
HCsấy = mcbột
mcd × 100%
Trong đó: Hcsấy: hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate trong quá trình sấy phun. mcbột: tổng lượng chondroitin có trong bột đạm thu được.
mcd: tổng lượng chondroitin có trong dịch thủy phân sụn cá mập dùng trong sấy phun.
* Hiệu suất thu hồi bột đạm của quá trình sấy phun: hiệu suất thu hồi bột đạm sau quá trình sấy phun (Hbđ) được tính bằng tỷ lệ phần trăm (%) giữa tổng lượng chất khô có trong bột đạm thu được sau sấy so với tổng lượng chất khô có trong dịch thủy phân sụn cá mập trước sấy.
23 Hbđ = mbột
mdd × 100%
Trong đó: Hbsấy: hiệu suất thu hồi bột đạm sau quá trình sấy phun. mbột: tổng lượng chất khô có trong bột đạm thu được sau sấy.
mdd: tổng lượng chất khô có trong dịch thủy phân sụn cá mập trước sấy.