Tổng hàm lượng phenol trong mẫu trà và dung dịch sau phản ứng được xác định theo quy trình ISO 14502-1-2005E của Tổ chức Tiêu chuẩn Quốc tế (ISO) để xác định tổng polyphenols trong trà, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Hàm lượng polyphenols được xác định trong dịch trà và dung dịch CuT sau phản ứng. Để hoàn thành phép đo cần sử dụng các dung dịch sau: thuốc thử Folin-Ciocalteu 10%, dung dịch natri carbonate 7,5%, dung dịch chuẩn acid gallic.
Xác định hàm lượng polyphenols trong dịch chiết trà. Dùng micropipet lấy 1ml dịch chiết trà cho vào bình định mức 100 mL và định mức bằng nước cất, trộn đều. Sau đó chuyển 2 mL dung dịch vừa pha loãng vào ống nghiệm, thêm 5 mL dung dịch Folin-Ciocalteu 10 %, trộn đều và ủ trong 5 phút. Tiếp đó, thêm 4ml natri carbonate 7.5 %, dung dịch được giữ trong 1 giờ và được đo độ mật độ quang ở bước sống 765 nm.
Tinh bột 4% Glycerol 1.2% Khuấy từ 1000 vòng/phút, 60 oC, 60 phút Màng CuT Dịch CuT Đun cách thủy, 30 phút
22
Dựng đường chuẩn gallic acid: Dung dịch gallic acid chuẩn 1 000 µg/mL được pha loãng ở các nồng độ khác nhau 10, 20, 30, 40, 50 µg/mL. Chuyển 2 mL các nồng độ gallic acid vào ống nghiệm. Thực hiện các bước tiếp theo tương tự như với dịch chiết trà.
Bảng 2.1. Nồng độ của dãy gallic acid chuẩn
Thể tích dung dịch gallic
acid chuẩn gốc (mL) Thể tích nước cất (mL)
Nồng độ dung dịch gallic acid chuẩn (µg/mL) 0.1 9.9 10 0.2 9.8 20 0.3 9.7 30 0.4 9.6 40 0.5 9.5 50 2.2.5. Quang phổ UV-Vis
Các tính chất quang học của dung dịch phức CuT được nghiên cứu bằng quang phổ UV-Vis (Alhafez et al., 2019). Phương pháp quang phổ UV-Visible được sử dụng để xác định đặc điểm của S. biafrae và phức của nó vì mỗi mẫu màu có một độ hấp thụ đặc trưng. Trong các phức hợp kim loại - flavonoid, sự thay đổi sắc độ bathochromic thường được quan sát thấy trong phổ UV-Visible vì phức chất này thường có màu (Malesev và Kuntic, 2007). sử dụng máy quang phổ chùm kép (máy quang phổ Double Beam Spectrophotometer UH5300 Hitachi) trong dải quang phổ từ 195 đến 800 nm. Phổ hấp thụ UV-Vis của tất cả các mẫu được ghi nhận và vẽ bằng phần mềm Excel.
2.2.6. Kính hiển vị điện tử quét
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được công nhận là trong các kỹ thuật phân tích hiện đại, đã được sử dụng trên toàn thế giới trong nhiều ngành. Nó có thể được coi là một phương pháp hiệu quả trong phân tích các vật liệu hữu cơ và vô cơ ở kích thước từ nanometer đến
23
micrometer (μm). SEM giúp quan sát được hình ảnh sắc nét ở độ phóng đại cao lên đến 300.000 và thậm chí 1.000.000 (trong một số kiểu máy hiện đại) để tạo ra hình ảnh rất chính xác trên nhiều loại vật liệu.
Mẫu màng chứa 80% dịch CuT và quả xoài đã được bọc màng CuT-80 được chụp SEM. Thiết bị JEOL 6400, điện thế hoạt động 5kV, chân không 1x10-4 Pa của Viện Hóa học.
2.2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum gloesporioides của màng tinh bột sắn bổ sung dung dịch CuT bổ sung dung dịch CuT
2.2.7.1. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloesporioidesin vitro của dung dịch CuT dịch CuT
Khả năng kháng nấm của dung dịch CuT được xác định theo phương pháp của (Hermida-Montero et al., 2019) Để xác định sự ức chế sự phát triển của sợi nấm, các mẫu nấm được ủ trong môi trường Nutrient broth (NB) trong đó có chứa một một lượng dung dịch CuT khác nhau. Hàm lượng cuối cùng của dung dịch CuT trong môi trường tăng trưởng là: 0, 50 %, 60 %, 70 % (tương ứng với nồng độ của ion đồng ban đầu là 1000 ppm, 1200 ppm, 1400 ppm). Tiếp đó, sợi nấm được chuyển vào trung tâm đĩa petri bằng que cấy mốc và được ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày. Các đĩa không có CuT được sử dụng làm mẫu đối chứng với cùng điều kiện sinh trưởng. Với mỗi mẫu khảo sát được thực hiện trong ba lần. Sự tăng trưởng của nấm mốc thông qua đường kính được đo trong vòng 6 ngày. tỷ lệ ức chế nấm được xác định bằng cách đo đường kính của khuẩn lạc và tính theo công thức như sau:
Hoạt lực ức chế (HLUC)(%)= [R1−R2
R1 ] × 100(2.1)
Trong đó R1 là đường kính của mẫu đối chứng và R2 là đường kính của mỗi mẫu chứa CuT.
2.2.7.2. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloesporioides của màng tinh bột bổ sung dung dịch CuT bổ sung dung dịch CuT
Màng tinh bột bổ sung dung dịch CuT đã chuẩn bị ở nồng độ 80 % - 1400 ppm Cu2+ . Mốc được cấy vào tâm của đĩa petri môi trường NB. Các mẫu màng được chuẩn bị ở kích thước 4x4 cm và phủ lên đĩa petri ngay sau khi cấy. Mẫu trắng và mẫu kiểm chứng được thực hiện tương tự tương ứng với mẫu không phủ màng và phủ màng tinh bột. Quan sát và so sánh sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày.
24
2.2.7.3. Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum gloesporioides của màng tinh bột bổ sung dung dịch CuT trên trái xoài bổ sung dung dịch CuT trên trái xoài
Nghiên cứu nhằm tìm hiểu mức độ phát triển của nấm gây bệnh sau khi được lây nhiễm trực tiếp và khả năng ức chế của màng chứa dung dịch CuT. Chọn những trái xoài có độ chín vừa phải, không có dấu hiệu bệnh, bề mặt láng; rửa xoài dưới vòi nước, dùng bông gòn tẩm cồn 70o để lau xoài. Xoài được làm tổn thương bằng cách sử dụng kim với đường kính 2 mm và vết thương sâu 2 mm, châm trực tiếp vào trái, số lượng 9 lỗ/trái. Cho huyền phù bào tử nấm C. gloeosporioideslên các vị trí đã đục lỗ trước đó, để khô trong 2 h. Dung dịch hồ tinh bột có bổ sung CuT với hàm lượng 80% được đổ lên bề mặt quả xoài.
Mẫu trắng và mẫu kiểm chứng được thực hiện tương tự tương ứng với mẫu không bao màng và bao bằng màng tinh bột không chứa CuT. Xác định tính gây hại của nấm và khả năng ức chế của màng dung dịch CuT so với trái đối chứng sau 5 ngày. Xác định hoạt lực ức chế theo công thức (2.1).
2.2.8. Khảo sát tính chất của màng 2.2.8.1. Khả năng kháng đâm xuyên 2.2.8.1. Khả năng kháng đâm xuyên
Thí nghiệm khả năng kháng đâm xuyên của màng thực hiện để xác định khả năng chống chịu lực tác động vuông góc với màng, được thực hiện theo phương pháp của (Saberi et al., 2017). Các mẫu màng đã chuẩn bị ở 2.2.3 được cắt với kích thước 40×40 mm. Cố định màng được cố định bằng 2 tấm kẹp có tâm khuyết (đường kính D = 7,8mm). Đầu dò TA-MTP 4R (đường kính d = 4mm) được lắp vuông góc với mẫu, điều chỉnh đầu dò di chuyển thẳng đứng tới bề mặt màng với tốc độ 0,1 mm/s đến khi đầu dò đâm thủng màng và đồng thời đường cong trở lực - độ biến dạng được ghi nhận. Các giá trị lực đâm xuyên tối đa (g), khả năng biến dạng (mm) tại thời điểm màng bị thủng được ghi lại để tính ứng suất đâm xuyên (puncture strength) và độ giãn trước khi thủng (mm), độ cứng của màng. Mỗi mẫu thực hiện lập lại 3 lần.Ứng suất đâm xuyên được tính theo công thức: (M. Preis, K. Knop, J. Breitkreutz, 2014).
P = 𝐹/𝐴 (MPa) (2.2)
Trong đó: F là lực đâm xuyên lớn nhất (N), A = π×( 𝑑/2)^2 = 12,56mm2 là diện tích vùng đâm xuyên.
25
Hình 2.4. Thiết bị đo khả năng kháng đâm xuyên CT3, Brookfield Engineering Labs, Inc.
2.2.8.2. Sự thay đổi màu sắc của màng và vỏ quả xoài
Thí nghiệm đo màu được thực hiện theo phương pháp của (Yasunaga et al., 2018). Sự thay đổi màu sắc của của các mẫu thí nghiệm được xác định bằng máy đo màu; đo các giá trị L, a và b của CIE (Commission International de l'Eclairge), 1976. Giá trị L tương ứng với độ sáng tối (sáng, L= 100; tối, L= 0), giá trị a tương ứng với thang màu đỏ-xanh lục (đỏ: dương; xanh lục: âm), giá trị b tương ứng với thang màu vàng-xanh dương (vàng: dương; xanh dương: âm) (Fukuda và cộng sự, 2014); do đó, chúng tôi giả định rằng các giá trị a và b đại diện cho hiện tượng xanh lá cây do mất chất diệp lục và vàng lá do tổng hợp β-carotene, tương ứng.
Các mẫu màng được chuẩn bị ở các nồng độ CuT khác nhau (0, 20 %, 40 %, 60 %, 80 %). Màng được cắt thành các miếng hình vuông 4x4 cm. Máy đo màu được sử dụng để so sánh sự khác nhau về màu sắc giữa các mẫu. Mỗi mẫu được thực hiện lặp lại ba lần.
Sư biến đổi màu sắc của vỏ quả trong suốt quá trình bảo quản bằng màng được thực hiện tương tự với thí nghiệm trên màng. Chọn những quả xoài có bề mặt láng để làm mẫu. Thí nghiệm thực hiện để quan sát sự khác biệt về màu sắc qua từng ngày giữa những quả xoài không bọc màng và bọc màng CuT. Mỗi mẫu lặp lại ba lần.
26
Hình 2.6. Thiết bị so màu CR401/400 Konica Minolta
2.2.9. Khảo sát khả năng bảo quản của màng trên quả xoài 2.2.9.1. Độ giảm khối lượng 2.2.9.1. Độ giảm khối lượng
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của (Lustriane et al., 2018). Sự sụt giảm khối lượng được đo dựa trên sự so sánh khối lượng của mẫu đã phủ màng với khối lượng của mẫu không được phủ màng ở cùng điều kiện điều kiện bảo quản, cân các mẫu hằng ngày. Phần trăm độ giảm khối lượng được tính toán bằng cách xác định sự chênh lệch giữa trọng lượng ban đầu và trọng lượng cuối cùng của xoài chia cho trọng lượng ban đầu.
WL =𝑊0−𝑊1
𝑊0 ×100 (2.3)
WL độ giảm khối lượng (%) W0 khối lượng của quả ban đầu (g) W1 khối lượng của quả lúc sau (g)
2.2.9.2. Độ cứng của quả xoài
Máy phân tích kết cấu (CT3, Brookfield Engineering Labs, Inc.) được sử dụng để phân tích độ cứng của quả xoài, thực hiện theo phương pháp của (Phimpharian et al. 2011). Sử
27
dụng đầu dò: 6F (đường kính 6 mm, bề mặt phẳng), tốc độ của đầu dò: 0.20 mm/s, độ sâu của đầu dò trên vỏ quả : 1 mm, nơi quả xoài được nén với lực tối đa. Độ cứng của da được ghi lại tại điểm có lực nén lớn nhất.
Các quả xoài được lựa chọn là các quả còn xanh, bề mặt láng, có kích thước tương đương nhau. Ba mẫu được khảo sát là quả không bọc màng, bọc màng tinh bột, bọc màng CuT. Mỗi mẫu được thực hiện ba lần.
2.2.10. Phương pháp phân tích
Tất cả dữ liệu thử nghiệm được báo cáo dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) bằng phần mềm SPSS (IBM, PASW 117 Statistics 19, USA). Sự khác biệt trong kết quả thí nghiệm đã được ANOVA so sánh. Giá trị P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Các kết quả thí nghiệm sẽ giúp khái quát về tính chất của phức giữa ion đồng và polyphenols trong dịch chiết trà xanh; cách tính chất hóa lý và kháng nấm của màng tinh bột, glycerol bổ sung dung dịch CuT; ứng dụng của màng trong bảo quản quả xoài.
3.1. Phản ứng giữa ion đồng và polyphenols (CuT) trong dịch chiết trà xanh 3.1.1. Tổng hợp phức đồng từ dịch chiết trà xanh 3.1.1. Tổng hợp phức đồng từ dịch chiết trà xanh
Hình 3.1 Thể hiện sự biến đổi màu sắc của dung dịch CuSO4 và dịch chiết trà trước và sau phản ứng. Dung dịch CuSO4 0,02M có màu xanh dương, trong khi dịch chiết trà có màu đỏ cánh gián. Khi hòa trộn hai dung dịch này lại có xuất hiện kết tủa màu nâu, chứng tỏ đã xảy ra phản ứng hóa học giữa CuSO4 và các thành phần trong dịch trà. Khi tiếp tục khuấy từ trong 90 phút thì dung dịch trở nên nâu sậm hơn. Kết tủa màu nâu này có thể là phức chất giữa ion Cu2+ với các hợp chất polyphenol trong dịch trà . Điều này đã được khẳng định trong các nghiên cứu của Alhafez và cộng sự vào năm 2019 (Alhafez et al., 2019). Ở nghiên cứu này, Alhafez đã khẳng định khi trộn dung dịch đồng hoặc kẽm với EGCG (một loại polyphenol có trong trà xanh) thì tạo thành dung dịch hơi hồng và hơi vàng. Azeez và cộng sự cũng đã có báo cáo về sự thay đổi màu sắc trong quá trình tổng hợp phức đồng từ chiết xuất của cây
Senecio biafrae. Trong nghiên cứu, Azeez đã ghi nhận màu của dung dịch chiết xuất Senecio biafrae giàu polyphenol chuyển sang màu xanh nâu khi khuấy với dung dịch muối đồng (Azeez et al., 2015) Sự khác biệt về màu sắc giữa nghiên cứu của Alhafez và Azeez với nghiên cứu của chúng tôi có thể là do thành phần polyphenols có sự khác biệt giữa các loại dịch chiết. Tuy nhiên vì hàm lượng lớn của EGCG ( 40% tổng lượng catechin (Alhafez et al., 2019)) nên vai trò tạo phức với đồng vẫn quan trọng nhất.
29
a b c d
Hình 3.1. Màu của các dung dịch a. Dịch chiết trà, b. CuSO4 0.02M, c. Dung dịch khi vừa trộn đều dịch chiết trà và dung dịch CuSO4 0.02 M, d. Dung dịch phản ứng CuSO4-trà sau 90
phút
3.1.2. Tổng hàm lượng polyphenols
Kết quả xác định hàm lượng polyphenols dựa trên đường chuẩn acid gallic (Hình 3.2) cho thấy dịch trà sau khi phản ứng với Cu2+ có hàm lượng polyphenol (~0,88 µg/mL) nhỏ hơn so với dịch trà ban đầu (~4,39 µg/mL). Điều này cho thấy rằng kết tủa này chính là hợp chất của polyphenol với ion Cu2+. Hiệu hai giá trị trên cho thấy ~3,52 µg/mL polyphenols trong dịch chiết trà đã tham gia phản ứng, chiếm gần 80% tổng lượng polyphenols ban đầu. Điều này chứng tỏ polyphenols trong dịch chiết trà là yếu tố chính tham gia phản ứng với Cu2+ để tạo phức.
30
Hình 3.2. Đường chuẩn acid gallic
3.1.3. Quang phổ UV-VIS
Hình 3.3. Độ hấp thu của dung dịch CuT và dịch chiết trà xanh y = 0.023489x + 0.038619 R² = 0.996533 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 10 20 30 40 50 60 Độ h ấp th ụ Nồng độ acid gallic (µg/mL) 0 1 2 3 4 5 180 380 580 780 Độ h ấp th u (A B S ) Bước sóng CuT Dịch chiết trà 207 nm 206 nm 272 nm 271 nm
31
Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa bước sóng và độ hấp thu của dung dịch CuT và dịch chiết trà được biểu diễn ở hình 3.3. Kết quả cho thấy có sự tương đồng về độ hấp thu của dung dịch CuT và dịch chiết trà. Tuy nhiên, ở cùng một bước sóng thì độ hấp thu của dung dịch CuT thấp hơn. Hình dạng và vị trí hai đỉnh hấp thụ trên cả hai đường phổ UV-vis trong hình 3.3 đều tương ứng với phổ hấp thụ của EGCG trong hình 3.4 (Alhafez et al., 2019). Việc đường phổ của dịch chiết bị thấp đi sau khi phản ứng với Cu2+ là do lượng polyphenol bị giảm đi do phản ứng tạo phức kết tủa với Cu2+. Việc hình dạng phổ không thay đổi cho thấy phức dạng rắn của polyphenol và Cu2+ không hấp thụ quang trong vùng bước sóng khảo sát.
Hình 3.4. Độ hấp thu lớn nhất của dung dịch EGCG tại hai bước song 216 nm và 274 nm (Alhafez et al., 2019)
32
3.2. Tính chất của màng
3.2.1. Khả năng kháng đâm xuyên
Hình 3.5. Kết quả thí nghiệm đâm xuyên màng bổ sung dịch CuT
Ứng suất đâm xuyên của màng tinh bột và glycerol bổ sung dung dịch CuT ở các hàm lượng khác nhau được ghi nhận lại trong bảng 3.5 . Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các mẫu màng đều có khả năng chống lại sự đâm xuyên; nói cách khác là đều bền cơ học. Ứng suất đâm xuyên của mẫu màng với 60% dung dịch CuT được bổ sung là lớn nhất, các thông số tăng dần theo các mẫu 0%, 20%, 40% và cao nhất là 60% sau đó giảm ở mẫu 80%. Tuy nhiên kết quả phân tích Oneway-Anova cho kết quả rằng không có sự khác biệt về ứng suất đâm xuyên giữa các mẫu. Điều này cho thấy dung dịch CuT không có ảnh hưởng đáng kể lên độ kháng đâm xuyên của màng tinh bột và glycerol. Tuy nhiên khi thu thập số liệu về độ dãn của màng trước khi thủng thì nhận thấy sự khác biệt giữa các màng. Màng chứa 20 % hàm lượng dung dịch CuT có độ dãn không khác biệt với màng chỉ có tinh bột và glycerol. Tương tự giữa màng chứa 40% và 80% hàm lượng dung dịch CuT cũng không cho thấy sự khác nhau, nhưng có sự khác nhau và độ dãn lớn hơn với hai màng 0 % và 20 %. Màng chứa 60% hàm lượng dung dịch CuT cho thấy độ dãn là lớn nhất và có sự khác biệt với tất cả các màng còn lại. Điều