- Độ thông khí: tốc độ tăng trưởng VSV trong giai đoạn lên men = giai đoạn nhân giống mật độ VSV trong mô
Sản xuất erythromycin
Sản xuất erythromycin từ Saccharopolyspora erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước - Cung cấp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp
- 9.000 hợp chất, chiếm 70-80% chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học do Actinomyces sản xuất:
• Chiếm 2/3 tổng số kháng sinh do VSV sản xuất
• 60% chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học không phải là kháng sinh
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
Xạ khuẩn Actinomyces:
- Có thể sử dụng Actinomyces với qui mô công nghiệp để sản xuất hợp chất polyketide có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như chống ung thư, kháng sinh, ức chế miễn dịch,…
- S. erythraea có khả năng sản xuất kháng sinh nhóm macrolid erythromycin – là một polyketide nhóm I
Sản xuất erythromycin từ S. erythraea
- Erythromycin được phân lập từ S. erythraea (trước đây có tên là Streptomyces erythraea)
- Waksman phân lập S. erythraea năm 1919
- 1952, hoạt tính kháng sinh của chủng S. erythraea
NRRL2338 có nguồn gốc từ chủng phân lập đầu tiên được công bố
- Chủng NRRL2338 sản xuất 0,25-1 g erythromycin trong 1 l môi trường, tùy điều kiện lên men
- Sau 50 năm, hiệu suất tăng gấp 10 lần, 10-13 g/l môi trường
- Quá trình sinh tổng hợp erythromycin do nhóm gen
ery có kích thước khoảng 60 kb mã hóa
- Quá trình lên men tạo hỗn hợp erythromycin A, B, C và D:
• Chỉ có erythromycin A là chất mong muốn
• Các chất khác là sản phẩm trung gian bị hydroxy hay methyl hóa
- Chủng VSV tốt có khả năng sản xuất 8-10 g/l erythromycin, chiếm >90% hàm lượng
- 1952, Lilly là công ty đầu tiên sản xuất erythromycin cung cấp cho thị trường
- Những năm 1970, Abbot là nhà cung cấp lớn nhất về số lượng cũng như giá trị
- Mỗi năm sản xuất ~ 4.000 tấn erythromycin: • 1.000 tấn dùng ở dạng erythromycin
• 1.500 tấn chuyển thành azithromycin • 1.500 tấn chuyển thành clarithromycin • 400 tấn chuyển thàng roxithromycin
Chọn giống, giữ giống và lên men
Khuẩn lạc S. erythraea
Các chủng năng suất cao dễ bị biến đổi di truyền liên tục phân lập lại để giữ chủng cho năng suất cao đồng thời có ít sản phẩm phụ erythromycin B, C
Chọn giống, giữ giống và lên men
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Chọn chủng từ ống thạch nghiêng, đông khô hay huyền phù bào tử
- Nuôi cấy trong 30 ml môi trường lỏng V1
- Sau 48 h, pha loãng và trải trên môi trường M1 hay CMAE-1 để thu các khuẩn lạc riêng rẽ
Chọn giống, giữ giống và lên men
1. Chọn chủng S. erythaea năng suất cao:
- Sau 10-14 ngày ủ ở 34 oC, khuẩn lạc mọc: • Giống ngôi sao
• Đường kính ~ 3 mm
• Màu xám hồng, mặt dưới màu nâu đậm
• Chọn các khuẩn lạc có hình thái khóm khác nhau và cấy trên ống thạch nghiêng
Chọn giống, giữ giống và lên men
2. Giữ giống S. erythaea:
- Ống thạch nghiêng:
• Ủ 10-14 ngày ở 34 oC
• Bảo quản ở 4 oC trong 1 tháng - Huyền phù bào tử:
• Thêm 5 ml nước vô trùng vào ống thạch nghiêng • Thêm 20% glycerol
• Phân nhỏ thành ống 1,5 ml
Chọn giống, giữ giống và lên men
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:
- 1 ml huyền phù bào tử mới pha hoặc 1,5 ml huyền phù bào tử đông khô + 30 ml môi trường V1. Ủ 40 giờ ở 34 oC trên máy lắc
- Lấy 3 ml dịch nuôi cấy + 27 ml môi trường F1, nuôi trong 9 ngày và bổ sung:
• Ngày 0-6: dầu đậu nành, 0,2 ml/ngày • Ngày 0-5: n-propanol, 0,1 ml/ngày
Chọn giống, giữ giống và lên men
Kiểm tra khả năng sản xuất erythromycin:
- Cân bình và bổ sung lượng nước bay hơi hàng ngày - Lấy mẫu, lọc và định lượng erythromycin
Chọn giống, giữ giống và lên men
3. Lên men:
- Giai đoạn 1: nuôi cấy giống trong 35 ml MT V1 - Giai đoạn 2: sau 48 giờ:
• Cấy vào 3,5 l môi trường V2 • Tốc độ thông khí 0,6 vvm
• Nhiệt độ 34 oC
Theo dõi lượng oxy hòa tan, pH, quá trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2
Theo dõi sự tăng trưởng: ly tâm đo thể tích hệ sợi hoặc cân sinh khối
Chọn giống, giữ giống và lên men
3. Lên men:
- Giai đoạn 3: sau ~ 40 giờ, chuyển 1,5 l dịch nuôi cấy vào bình lên men 20 l chứa 10 l môi trường F1
• Nhiệt độ 34 oC
• Chỉnh pH ≤ 7,2 bằng H2SO4 • Tốc độ khuấy 700 vòng/phút
• Tốc độ thông khí 0,37 vvm trong 12 giờ đầu, sau đó tăng lên 0,83 vvm
• Duy trì dinh dưỡng: dầu đậu nành, n-propanol, dextrin
Chọn giống, giữ giống và lên men
3. Lên men:
- Giai đoạn 3:
Theo dõi quá trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2, glucose tự do
Hàng ngày lấy 50-100 ml dịch nuôi cấy để định lượng erythromycin
Soi kính hiển vi để kiểm tra ngoại nhiễm và hình thái VSV
Chiết tách erythromycin
Tách erythromycin gồm các bước chính:
1. Tách erythromycin-isothiocyanat 2. Tạo erythromycin base
Chiết tách erythromycin
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
- Chỉnh pH 8,5 bằng NaOH 20%
- Ly tâm với vận tốc 3.000 g ở 4 oC để loại bỏ sinh khối. Dịch nổi tiếp tục lọc bằng sợi thủy tinh
- Chỉnh pH 9,5 ± 0,1
- Thêm 1,5% methylisobutylketon và khuấy đều trong 10 phút ở 4 oC
- Ly tâm với vận tốc 2.000 g trong 5 phút
- Thu pha hữu cơ và định lượng erythromycin bằng HPLC
Chiết tách erythromycin
1. Tách erythromycin-isothiocyanat
- Đun pha hữu cơ đến 30 oC, thêm 0,63 l dung dịch Na isothiocyanat 33% cho mỗi gam erythromycin
- Chỉnh pH 5,8 bằng acid acetic 10%
- Làm nguội hỗn hợp đến 10 oC, ủ trong 3 giờ và khuấy nhẹ để kết tinh erythromycin, duy trì pH 5,8
- Lọc và rửa tủa bằng nước cất - Sấy chân không ở 50 oC
Chiết tách erythromycin
2. Tạo erythromycin base
- Hòa tan bằng cách khuấy nhẹ erythromycin –
isothiocyanat trong dichloromethan ở 33 oC, chỉnh pH 9,5-10 bằng NaOH 15%
- Lọc huyền dịch với chất trợ lọc, than hoạt. Rửa lại bằng 1 lượng nhỏ dichloromethan
- Tách pha hữu cơ (dịch lọc) với nước khử ion ở 33 oC, khuấy nhẹ
- Cô quay dịch chiết để tăng nồng độ erythromycin
Chiết tách erythromycin
2. Tạo erythromycin base
- Kết tinh erythromycin ở 5 oC trong 3-5 giờ
- Phục hồi erythromycin bằng ly tâm hay lọc, rửa lại bằng dichloromethan, sấy khô ở 50 oC
- Hòa tan erythromycin base thô trong nước khử ion và đun ở 50-60 oC
- Thêm lauryl sulfat. Ly tâm hay lọc, rửa với nước khử ion (60 oC) để thu erythromycin base tinh khiết
- Erythromycin base có thể chuyển thành dạng ester, muối hay dẫn chất bán tổng hợp
Chiết tách erythromycin
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
Thử hoạt tính sinh học của eruthromycin bằng phương pháp sinh học và thực hiện song song với
erythromycin chuẩn, gồm các bước:
- Đổ 35 ml môi trường TSB vào hộp petri (12x12 cm) - Khi môi trường đông đặc, thêm lớp thứ hai gồm 35
ml TSB và 35 μl dịch nuôi cấy của Micrococcus luteus
Chiết tách erythromycin
3. Thử hoạt tính sinh học và độ tinh khiết
- Nhỏ 10 μl phần nổi của dịch nuôi cấy (hoặc dạng hòa tan trong methanol) lên đĩa thử kháng sinh đặt trên bề mặt hộp thạch. Ủ ở 30 oC trong 48 giờ, đo vùng ức
chế tăng trưởng của M. luteus và tính lượng erythromycin dựa vào đường cong chuẩn
- Thử độ tinh khiết bằng HPLC: định lượng erythromycin A, B, C