Để thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo ổn định và hiệu quả, một số yếu tố đã đƣợc khảo sát để tìm ra quy trình tối ƣu.
* Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K
Proteinase K có tác dụng phân hủy keratin (một thành phần protein chính của lông) và bảo vệ những acid nucleic bằng cách phá hủy enzyme ribonuclease (McNevin và cs, 2005). Thí nghiệm 1 đƣợc bố trí nhằm khảo sát khả năng phân cắt keratin của proteinase K ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình 1 sử dụng proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml; quy trình 2 sử dụng proteinase K nồng độ 1 mg/ml và quy trình 3 sử dụng proteinase K nồng độ 1,2 mg/ml (các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong quy trình tham khảo). Các bƣớc tiến hành theo quy trình tham khảo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane khi sử dụng DNA ly trích từ lông theo quy trình này.
* Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT
Ngoài proteinase K có khả năng cắt phân tử keratin thì DTT cũng có khả năng phân cắt keratin tốt. Theo Manual của Biorad (2005), DTT có khả năng cắt đứt nối S–S trong phân tử cystein của keratin. Thí nghiệm 2 đƣợc bố trí nhằm mục tiêu khảo sát xem nồng độ nào của DTT thì cho DNA chất lƣợng tốt . Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình ly trích 1 sử dụng DTT với nồng độ 50 mM; quy trình 2 sử dụng DTT với nồng độ 65 mM và quy trình 3 sử dụng DTT với nồng độ 80 Mm. Sử dụng proteinase K theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 1. Các bƣớc thực hiện giống nhƣ thí nghiệm 1. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi và sản phẩm PCR xác định gen halothane. Mẫu sử dụng là mẫu gốc lông heo. Số mẫu thí nghiệm là 4 mẫu cho mỗi quy trình.
22
* Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB
DTT chỉ phân cắt keratin mà không có khả năng loại bỏ đƣợc melanin. Theo Giambernardi và cs (1998), melanin làm ức chế phản ứng PCR. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có thể loại bỏ melanin ra khỏi DNA ly trích. Do đó, thí nghiệm 3 đƣợc bố trí để so sánh chất lƣợng DNA ly trích giữa 3 quy trình: quy trình 1 không sử dụng CTAB; quy trình 2 sử dụng CTAB nồng độ 0,1% và quy trình 3 sử dụng CTAB nồng độ 0,2%. Sử dụng DTT theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 2. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 2. Các bƣớc đƣợc thực hiện theo trình tự của thí nghiệm 2. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane.