V. Phương pháp xác định hoạt độ
3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase )
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose. b/ Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan pH
=4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.
4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao a) Chủng giống vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra chế phẩm Amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các giống mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột biến, tách và cấy
gen.
Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so với ban đầu.
b) Môi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để sinh tổng hợp Amylase.
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngoài ra còn
chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin...
Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như
trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia...
Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19% trấu. Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: t o 32OC, độ ẩm 57% và
Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose, fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế sự tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể bổ sung thêm từ khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể phát triển tốt trong môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới 0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít có hiệu quả về phương diện tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm, rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.
Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg 2+, Ca2+ và photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu MgSO 4, Amylase hầu như không đc tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH 2PO4 vào khoảng 0,1 - 0,2%.
Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase có tới 2 hoặc 3 ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi có trong phân tử; nhưng cũng có ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này còn phụ thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic.
Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ Amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm –SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu tạo thành Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml.
Hoạt độ của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt
Chủng Vi sinh vật Asp.oryae KC
Asp.oryae U476 Asp.niger S4-10-111
c) Điều kiện nuôi cấy
Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm:
• Nhiệt độ
Cần phải có trang bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường. Bằng cách quạt không khí lạnh và ẩm vào canh trường. Nếu nuôi cấy trong môi trường lỏng thì cần làm lạnh đồng thời kết hợp với sục khí.
Nhiệt độ không khí trước khi đưa vào phòng nuôi phải vào khoảng 22 – 25 0C, còn độ ẩm tương đối của không khí là 98 - 100%.
• Độ ẩm canh trường
Trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm, độ ẩm tối ưu để nấm mốc phát triển nằm trong giới hạn 65 - 70%. Trong thực tế sản xuất, mức độ vô trùng không thể đạt được như trong phòng thí nghiệm nên người ta thường nuôi cấy trong canh trường có độ ẩm thấp hơn, nhằm hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn.Tùy theo điều kiện trang thiết bị ở mỗi nơi mà độ ẩm có thể khống chế ở 50 - 60%. Độ ẩm canh trường thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhưng nấm mốc cũng phát triển chậm dẫn đến tích tụ Enzyme ít và phải kéo dài thời gian. Do đó vấn đề cần đặt ra là phải bằng mọi biện pháp thực hiện tốt công việc vệ sinh. Muốn vậy trước hết phải tiệt trùng môi trường ở áp suất và thời gian thích hợp nhằm tiêu diệt các tế bào và bào tử vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu dùng làm môi trường.
Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm mốc thải ra một lượng nhiệt khá lớn nên canh trường bị nóng và làm giảm độ ẩm. Đổ nước lạnh xuống nền và phun nước quanh tường sẽ góp phần giảm nhiệt và giúp cho canh trường đỡ bị khô.
• pH môi trường
Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt trên canh trường rắn, pH ít ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm mốc, thường áp dụng pH tự nhiên của môi trường vào khoảng 5,5 - 6,0. pH thấp thì hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng sẽ ảnh hưởng tới tích tụ Enzyme. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng: pH ban đầu thường vào khoảng 6 - 7. Đối với Asp.orysee sau 3 ngày nuôi cấy pH giảm còn 5,5 - 6,0. Ngược lại khi nuôi Asp.awamori để nhận glucoamylase, sau 52 giờ pH tăng tới 7,6 - 7,8.
Thực tế pH có ảnh hưởng nhiều tới tích tụ Enzyme, vì thế trong sản xuất người ta sử dụng acid hoặc amoniac để điều chỉnh, giữ cho pH luôn trong giới hạn tối ưu.
• Cung cấp oxy
Trong quá trình phát triển và tích tụ Enzyme, nấm mốc rất cần oxy. Trong sản xuất sinh học, sự phát triển của tế bào và tích tụ Enzyme có liên quan mật thiết tới sự có mặt của oxy.
Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt, nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với oxy của không khí qua sợi nấm và mixen. Vì thế canh trường phải xốp, giúp cho nấm mốc tạo nhiều sợi và tích tụ Enzyme. Nếu môi trường dính bết, không khí ít tiếp xúc thì sẽ xảy ra hô hấp yếm khí, ảnh hưởng xấu đến tích tụ Enzyme. Vì vậy ở mỗi giai đoạn của sự phát triển, tùy vào lượng oxy cần cho quá trình trao đổi chất và lượng nhiệt nấm mốc tỏa ra mà điều chỉnh lượng không khí vào phòng nuôi cho thích hợp. Yêu cầu về lượng không khí và cung cấp oxy trong môi trường lỏng có những khác biệt. Yêu cầu đặt ra là phải làm sao để oxy của không khí hòa tan vào canh trường càng nhiều càng tốt. Trong canh trường lỏng tế bào nấm mốc phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của chúng với oxy phải thông qua canh trường – khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy có thể hòa tan vào dung dịch. Lượng oxy hòa tan trong canh trường phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, áp suất, công nghệ sục khí cũng như hàm lượng và tính chất của các chất hòa tan trong dung dịch.
C. Ứng dụng Enzyme Amylase
Amylase là nhóm Enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ sản xuất rượu bia, công nghệ thực phẩm…đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất bia. Trong lĩnh vực sản xuất bia Amylase được sử dụng để đường hóa tinh bột thành maltose, glucose dùng làm cơ chất cho quá trình lên men bia.
+Trong công nghiệp sản xuất rượu bia (giai đoạn đường hoá tinh bột )
+Trong công nghiệp sản xuất tương , mạch nha , mật, đường glucose ….
+ Từ tinh bột có thể làm cơm rượu làm thức ăn cho gia súc rất giàu chất dinh dưỡng
+ Amylase còn được ứng dụng trong sản xuất làm bánh mì , làm cho bánh nở xốp thơm ngon hơn .
+ Trong công nghiệp dệt chế phẩm Enzyme Amylase còn dùng để rũ hồ vải là
+ Trong công nghiệp sản xuất bột ngọt
I. Ứng dụng trong sản xuất Bia
Bia là loại đồ uống có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ Enzyme khá phong phú, đặc biệt là nhóm Enzyme kích thích tiêu hóa
Nguyên liệu sử dụng : Ngũ cốc , hoa Houblon, nước , Nấm men, chất phụ gia Các chủng vi sinh vật sử dụng:
+Saccharomyces cerevisisae ( Lên men nổi)
+Saccharomyces cerevisidae (Lên men chìm)
Tinh bột là thành phần chiếm vị trí số một của hạt đại mạch cả về số lượng lẫn vai trò của nó trong sản xuất bia. Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng Enzyme Amylase có trong mầm đại mạch.
Ngoài ra, còn sử dụng các Enzyme khác có trong mầm đại mạch để thủy phân và chuyển hoá các chất không tan sang trạng thái tan như chuyển protein, cellulose… sang amino acid và glucose .
Các quá trình công nghệ này đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới. So với các loại Enzyme Amylase từ các nguồn khác, Amylase từ thóc đại mạch đã được nảy mầm được sử dụng với số lượng nhiều nhất hiện nay.
Quá trình hạt đại mạch nảy mầm là quá trình sinh tổng hợp Enzyme Amylase và nhiều Enzyme khác
Nhờ sự tổng hợp ra những Enzyme này, hạt tiến hành quá trình tự phân hủy tinh bột, protein và các hợp chất khác để cung cấp nguyên liệu và năng lượng cho hạt nảy mầm
Enzyme Amylase tác động vào giai đoạn đường hóa:
Biến đổi tinh bột đã qua giai đoạn dịch hóa thành Dextrin và Maltose tác động tạo Dextrin hóa, β - Amylase tác động tạo mantose.
α -Amylase
Tinh bột Dextrin + maltose + glucose
Thủy phân α -1,4 của amylose
β -Amylase
Tinh bột Maltose + β - Dextrin
Trong gian đoạn lên men tiếp theo, các chất đường, dextrin có phân tử thấp sẽ được chuyển hóa thành rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm.
1. Đường hóa nguyên liệu: a. Chuẩn bị nguyên liệu:
Malt là nguyên liệu chính cung cấp tinh bột và Amylase cho đường hóa. Malt: là tên gọi ngũ cốc nảy mầm ( Đại mạch, tiểu mạch, thóc gạo, lúa mì đen, thóc nếp…). Trong sản xuất bia, người ta dùng chủ yếu là đại mạch nảy mầm. Hạt đại mạch là nguồn cung cấp nguyên liệu cho đường hóa , tạo đường cho sự lên men về sau .
Trong quá trình nảy mầm của hạt sẽ tích tụ được nhiều men mới, tăng hoạt tính hàng loạt men và Amylase tăng hoạt tính đáng kể, cần thiết cho quá trình đường hóa.
Hoạt lực của α-Amylase có thể ghi nhận được vào những thời điểm đầu tiên của quá trình ươm mầm, còn đến ngày thứ ba hoặc ngày thứ tư thì hoạt lực của chúng sẽ tăng một cách đáng kể. Thời gian để α-Amylase đạt được hoạt lực cực đại phụ thuộc vào nhiệt độ ươm mầm. Ví dụ ở nhiệt độ 12 – 140C hoạt lực đạt cực đại sau 11 – 12 ngày đêm, nếu ở nhiệt độ 18 – 200C hoạt lực đạt cực đại sau 6 – 7 ngày đêm. Còn nếu nhiệt độ 25 – 28 0C thì chỉ cần sau 4 ngày là Enzyme này đạt được hoạt độ tối đa.
Ngoài Amylase hoạt độ của protease, sitase, maltase, phosphatase cũng tăng lên.
Quá trình oxy hóa – khử lượng men tạo thành tập trung phần lớn ở gần phôi và nội nhũ. Phần trên nội nhũ chứa 25% lượng men có trong malt. Trong quá trình nảy mầm có một số quá trình sinh hóa xảy ra như sau: Thủy phân một phần tinh bột ( 20 – 25% ) ra đường đơn giản hơn. Đường oligo - polysaccharide có bị phân giải một phần thành monosaccharide và trisaccharide. Lipase thủy phân một phần lipid thành acid béo và glycerine
Do việc tạo thành acid hữu cơ và vô cơ nên độ chua của hạt này mầm tăng cao , pH 5,6 – 5,9.
b. Đường hóa:
Đường hóa là công đoạn sản xuất bia rất quan trọng, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này. Chính vì thế, nhiều nhà máy bia trên thế giới đã cho thêm Enzyme với số lượng lớn trong giai đoạn này. Các Enzyme vào trong giai đoạn này là những Enzyme vi khuẩn chịu nhiệt.
Biến đổi sinh hóa của quá trình đường hóa là thủy phân tinh bột thành dextrin và đường đơn giản (maltose, glucose…) dễ tan và lên men dưới tác dụng của Amylase trong malt, ở nhiệt độ và pH tối ưu .
Có quá trình thủy phân protid – peptid , peptone, acid amin hòa tan được trong dung dịch nhờ Enzyme protease, peptidase có trong malt.
Cellulose, peptin cũng bị thủy phân, tạo thành sản phẩm hòa tan được trong dung dịch, tamin bị oxy hóa tạo ra Flobafel tạo thêm màu cho bia
Malt xay nhỏ trộn với nước thành dịch hồ, nâng nhiệt độ lên 60 – 70
0C giữ trong 30 đến 40 phút, sau đó nâng lên nhiệt độ 75 0C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi đường hóa xong (PH 4,6 - 5,8 )
Hiện nay có nhiều phương pháp đường hóa, nâng nhiệt độ nhiều đợt 2 - 3 lần hoặc nâng nhiều đợt từng phần riêng rồi pha trộn lẫn nhau
Với nguyên liệu fi-malt giàu bột (ngũ cốc) trước khi đường hóa và trộn malt cần xay nhỏ trộn nước nấu sơ bột thành hồ hoặc cháo loãng, dung dịch đường hóa gọi là dịch đường maltose, lọc xong ta có nước “mout”. Nước “mout” được đun sôi với hoa houblon ( 18 -26g/10 lít bia ở Việt Nam) .
Trong nước “mout”, sau khi đường hóa có chứa 90% là các chất Carbohydrate, trong số này có đến 75% đường có khả năng lên men. Phần còn lại 25% là các loại dextrin mạch thẳng và mạch nhánh. Trong nhiều trường hợp, lượng đường tạo thành không đạt được mức độ trên do nhiều nguyên nhân. Trong đó nguyên nhân chính là chất lượng malt kém. Có ba cách để làm tăng lượng đường trong nước “mout”:
+Kéo dài thời gian đường hóa
+Sử dụng thêm đường
+Sử dụng Enzyme để đường hóa hết lượng tinh bột