Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng khoảng 20-35 g, khoảng 7 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp từ Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. Chuột được nuôi ở điều kiện phòng thí nghiệm 7-15 ngày.
Nội dung nghiên cứu
1. Khảo sát lựa chọn tá dược, từ đó xây dựng công thức bào chế emulgel tioconazol 1,0 %.
2. Đánh giá một số đặc tính của emulgel tioconazol thu được: về hình thức, pH, hàm lượng tioconazol trong chế phẩm, khả năng giải phóng dược chất qua màng, chỉ số kết dính sinh học và khả năng hút nước.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Khảo sát phương pháp định lượng tioconazol bằng quang phổ UV – Vis
Định lượng tioconazol bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV – Vis [28]. Tham khảo tài liệu [13] [28], tiến hành định lượng tioconazol như sau:
❖Quét phổ hấp thụ của tioconazol để xác định bước sóng hấp thụ cực đại.
19
dung dịch chuẩn gốc và pha loãng đến nồng độ 10 µg/ml.
– Quét phổ hấp thụ của dung dịch trên trong khoảng bước sóng 210 – 390 nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của tioconaol.
❖Xây dựng đường chuẩn định lượng tioconazol.
– Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 0,01 g tioconazol hòa tan trong vừa đủ 100 ml methanol, được dung dịch gốc S (dung dịch S) nồng độ 100 µg/ml. Pha loãng dung dịch S để thu được dãy dung dịch chuẩn có khoảng nồng độ 2-12 µg/ml.
– Mẫu trắng: methanol.
– Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ tioconazol.
2.3.2.Phương pháp xác định độ tan của tioconazol trong các dung môi
Tiến hành xác định độ tan của TCZ trong hai dung môi là ethanol và propylen glycol (PG) theo quy trình sau:
•Bước 1: Cân chính xác khoảng 5,00 gam TCZ hoà tan trong chính xác 10 ml dung môi (ethanol hoặc PG) trong lọ thuỷ tinh có nắp đậy kín.
•Bước 2: Tiến hành khuấy từ liên tục 48 giờ ở 25⁰C.
•Bước 3: Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm.
•Bước 4: Hút chính xác 1 ml dịch trong đem pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng methanol. Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV – Vis. Tính toán độ tan của TCZ trong ethanol và PG.
2.3.3.Phương pháp bào chế emulgel tioconazol
Thành phần cơ bản của công thức emulgel tioconazol được thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần cơ bản của emulgel tioconazol
STT Thành phần Phần trăm khối lượng
1 Pha dầu Lipid lỏng khảo sát 2 Lipid rắn khảo sát 3 Span 80 1 4 Pha nước Tween 80 khảo sát 5 Polyme khảo sát 6 Tioconazol 1
20
7 Ethanol 2,5
8 PG 5
9 Nipagin 0,03
10 Nipasol 0,01
11 Nước tinh khiết vừa đủ khối lượng
Lựa chọn loại và lượng các tá dược được thực hiện sau khi tham khảo các tài liệu [9], [10], [28].
Emulgel tioconazol được bào chế theo phương pháp như sau:
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế emulgel tioconazol
•Bước 1: Cân các thành phần theo công thức.
•Bước 2: Ngâm trương nở polyme ( Carbopol 934, HEC, HPMC K4M hoặc NaCMC ) với lượng nước cất thích hợp để tạo gel trong một cốc có mỏ (riêng HPMC K4M thì cần phân tán đều polyme trong nước nóng khoảng 70⁰C) và để qua đêm ở nhiệt độ phòng cho gel trương nở.
Thêm từ từ polyme vào nước
tinh khiết Ngâm trương nở
qua đêm
Hoà tan TCZ, nipagin, nipasol vào hỗn hợp Tween
80, PG, ethanol Đun chảy lipid rắn Thêm Span 80, lipid lỏng Pha dầu (đun nóng 60-65⁰C) Pha nước (đun nóng 65-70⁰C)
Nhũ hoá pha dầu trong pha nước
21
•Bước 3: Thêm từng giọt TEA vào gel đã trương nở để điều chỉnh pH (riêng với Carbopol).
•Bước 4: Trong một cốc có mỏ khác, hoà tan tioconazol, nipagin, nipasol trong hỗn hợp Tween 80, ethanol và PG.
•Bước 5: Phối hợp từ từ dung dịch dược chất vào gel kết hợp trộn nhẹ nhàng đến đồng nhất (pha nước).
•Bước 6: Đun nóng pha nước ở 65-70⁰C.
•Bước 7: Đun chảy lipid rắn. Thêm Span 80 và lipid lỏng vào hoà tan. Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 60-65⁰C (pha dầu).
•Bước 8: Cho pha dầu vào pha nước trong một cối sứ nóng, dùng chày đánh nhanh và mạnh trong khoảng 2-3 phút để thu được nhũ tương, vét cối và trộn nhẹ nhàng đến khi khối thuốc mịn màng, đồng nhất.
•Bước 9: Đóng lọ và bảo quản chế phẩm nơi khô ráo, thoáng mát.
2.3.4.Phương pháp đánh giá emulgel tioconazol
2.3.4.1. Đánh giá hình thức
Quan sát bằng mắt thường về thể chất, màu sắc, độ đồng nhất của emulgel. Yêu cầu: emulgel tioconazol có màu trắng, đồng nhất, thể chất mịn, không có bọt khí.
2.3.4.2. Đánh giá pH
Tiến hành đo pH trên bề mặt emulgel tioconazol bằng máy đo pH Mettler Toledo.
2.3.4.3. Đánh giá khả năng hút nước
Khảo sát mức độ hút nước của emulgel sử dụng chất tạo gel là Carbopol 934. Phương pháp tiến hành sau khi tham khảo tài liệu [28] :
• Cân chính xác khoảng 1 gam emulgel trong cốc có mỏ khô đã xác định chính xác khối lượng trước đó để có W0.
• Thêm 10 ml nước cất vào cốc mỏ đã chứa emulgel.
• Tại các thời điểm xác định đổ hết nước khỏi cốc và cân lại cốc gel để tính toán và xác định khối lượng gel sau khi ngâm nước (Wt). Mỗi công thức thực hiện cân 4 cốc ứng với 4 thời điểm 0, 1, 2 và 3 giờ.
Xác định khả năng hút nước của emulgel theo công thức sau:
Chỉ số hút nước (%) = 𝒘𝒕−𝒘𝟎
22 Trong đó:
• W0: khối lượng gel ban đầu
• Wt: khối lượng gel sau thời gian t (giờ).
2.3.4.4. Đánh giá khả năng kết dính sinh học
Để xác định chỉ số kết dính sinh học của các mẫu emulgel có thay đổi loại và lượng polyme, sử dụng thiết bị đo độ bền gel Texture analyzer CT3 1500 (hình 2.2). Phương pháp tiến hành tham khảo tài liệu [7].
Hình 2.2. Thiết bị đo chỉ số kết dính sinh học
–Chuẩn bị da chuột: Da chuột nhắt trắng được loại bỏ hoàn toàn lông nhưng vẫn giữ được lớp biểu bì nguyên vẹn, xử lý xong da chuột trong vòng 25 - 30 phút sau khi chuột chết, bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý và tiến hành thí nghiệm trong vòng 1 giờ sau đó.
–Tiến hành đo chỉ số kết dính sinh học như sau: ❖Da chuột được cố định ở khối trụ A.
❖Emulgel được điều nhiệt tới 35˚C và dàn mỏng thành một lớp đường kính 2 cm, bề dày 3 mm trên đĩa petri tại vị trí B.
❖Sử dụng chế độ đo Tension với giá trị mồi (trigger) là 0 g, khoảng cách biến dạng (deformation) không đổi là 51 mm. Da chuột gắn trên khối trụ được hạ xuống từ từ, tiếp xúc và nhấc ra khỏi emulgel. Kết quả thu được lực lớn nhất P (peak load) là lực dùng để tách da ra khỏi gel sau khi tiếp xúc.
❖Thay miếng da chuột mới sau mỗi lần đo. Mỗi mẫu emulgel được tiến hành đo 2 lần và lấy kết quả trung bình.
23
F = 𝑷
𝑺
Trong đó:
• F là chỉ số kết dính sinh học (N/cm2) • P là lực lớn nhất trong quá trình đo (N)
• S là diện tích bề mặt của khối trụ (S=1,23 cm2)
2.3.4.5. Đánh giá đặc tính lưu biến
Qua tham khảo tài liệu, tiến hành khảo sát đặc tính lưu biến của emulgel với các điều kiện như sau:
–Thiết bị đo: Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer với mô hình: côn - đĩa CP4/40, đường kính côn 40 mm góc côn: 4°1‘08‘‘ (4 độ 1 phút 08 giây).
–Lượng mẫu: 1 ml.
–Sử dụng chế độ trượt liên tục (flow sweep), khoảng tốc độ trượt là từ 0,1 s-1 đến 100 s-1 (giai đoạn 1) trong 30 giây mô phỏng quá trình lấy emulgel khỏi bao bì và bôi lên da sau đó tiếp tục đo với khoảng tốc độ trượt là từ 100s-1 về 0,1 s-1 (giai đoạn 2) trong 30 giây mô phỏng trạng thái của emulgel ngay sau khi bôi trên da.
–Mẫu được để ổn định 60 giây để điều chỉnh nhiệt độ của mẫu về 25°C ± 1oC trước khi đo.
2.3.4.6. Xác định hàm lượng dược chất trong chế phẩm
Định lượng tioconazol trong emulgel bằng phương pháp đo quang phổ UV – Vis. –Mẫu thử: Hoà tan một lượng xác định emulgel tương ứng với khoảng 10 mg tioconazol trong 100 ml methanol. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm. Tiến hành pha loãng dịch lọc trong methanol ở tỉ lệ nhất định để thu được dung dịch thử có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính tại bước sóng cực đại hấp thụ.
–Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn và tính nồng độ tioconazol của mẫu thử theo công thức:
Ct = Cc x 𝑨𝒕
𝑨𝑪 x D
Trong đó:
• Ct và Cc lần lượt là nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn (μg/ml). • At và Ac lần lượt là độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn. • D là hệ số pha loãng của mẫu thử.
24
Phương pháp định lượng DC trong emulgel tham khảo tài liệu [28].
2.3.4.7. Đánh giá khả năng giải phóng tioconazol qua màng da chuột
Thí nghiệm đánh giá khả năng giải phóng tioconazol qua màng được tiến hành sau khi nghiên cứu điều kiện thực tế và tham khảo tài liệu [13], [20], [28].
❖Thiết bị
Sử dụng hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research. Ngăn chứa mẫu đựng emulgel, ngăn nhận chứa môi trường khuếch tán, màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn.
❖Điều kiện thử
– Màng giải phóng: Da lưng chuột nhắt đã được xử lý loại lông, không làm tổn thương lớp biểu bì trên da. Lớp mỡ dưới da được bóc tách bằng kéo phẫu thuật.
– Môi trường khuếch tán: 7 ml dung môi là dung dịch đệm phosphat pH 5.5. – Tốc độ khuấy: 100 vòng/phút.
– Nhiệt độ thử: 32oC ± 1oC.
– Mẫu thử: 0,5 g emulgel tioconazol.
– Lấy mẫu tại các thời điểm t = 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 24 giờ. Thể tích mỗi lần lấy mẫu là 1 ml. Quá trình lấy mẫu đồng thời cũng bổ sung vào ngăn nhận 1 ml dung môi mới. Mẫu thử đem pha loãng bằng đệm phosphat 5.5 đến nồng độ thích hợp và định lượng bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV - Vis.
❖Đánh giá:
Phần trăm tioconazol giải phóng qua màng tại mỗi thời điểm so với lượng tioconazol có trong mẫu thử được tính như sau:
–Tổng lượng dược chất đã giải phóng từ emulgel tại lần lấy mẫu thứ n:
Qn = V x Cn + v x ∑𝒏−𝟏𝒊=𝟏 𝑪𝒊 Trong đó:
• Qn: tổng lượng dược chất đã giải phóng ở lần lấy mẫu thứ n (µg) • V: thể tích môi trường khuếch tán (V = 7 ml)
• v: thể tích mỗi lần lấy mẫu (v = 1 ml)
• Cn: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán lần lấy mẫu thứ n (µg/ml) • Ci: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm i (µg/ml) – Phần trăm dược chất đã giải phóng từ emulgel tại lần lấy mẫu thứ n:
25
Xn= 𝐐𝐧
𝐌 x 100%
Trong đó:
• Xn: phần trăm dược chất giải phóng tại lần lấy mẫu thứ n (%) • Qn: lượng dược chất đã giải phóng ở lần lấy mẫu thứ n (µg) • M: khối lượng dược chất có trong mẫu emulgel (µg)
2.3.5.Phương pháp xử lý số liệu
- Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả trung bình. Các số liệu được xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD.
26
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát phương pháp định lượng tioconazol bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis
Để có cơ sở cho việc nghiên cứu bào chế, đề tài đã tiến hành khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và khoảng tuyến tính của phép định lượng tioconazol bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis.
3.1.1.Xác định phổ hấp thụ của tioconazol
Tiến hành ghi lại phổ hấp thụ của dung dịch tioconazol có nồng độ khoảng 10 µg/ml trong khoảng bước sóng từ 210 - 390 nm. Kết quả được trình bày trong hình 3.1
Hình 3.1. Phổ hấp thụ quang phổ UV – Vis của tioconazol
Trong khoảng bước sóng từ 210 - 390 nm, dung dịch có 1 cực đại hấp thụ tại bước sóng 230,0 nm nên nghiên cứu có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ UV – Vis để định lượng tioconazol.
Vậy nghiên cứu quyết định chọn phương pháp định lượng chế phẩm emulgel tioconazol là đo quang phổ hấp thụ UV – Vis tại bước sóng 230,0 nm.
3.1.2.Thẩm định khoảng tuyến tính tính của phương pháp định lượng tioconazol bằng phương pháp quang phổ UV-Vis phương pháp quang phổ UV-Vis
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn TCZ trong methanol với các nồng độ trong khoảng 2 - 12 µg/ml theo phương pháp đã được mô tả ở mục 2.3.1. Xây dựng đồ thị thể hiện mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ TCZ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.2.
Bảng 3.1. Mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ tioconazol
Nồng độ (µg/ml) 2,02 4,04 6,06 8,08 10,10 12,12 Độ hấp thụ 0,180 0,289 0,423 0,563 0,697 0,830 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 210 230 250 270 290 310 330 350 370 390 Độ hấp thụ λ(nm)
27
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ quang với nồng độ tioconazol trong methanol
Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.2 cho thấy trong khoảng nồng độ tioconazol từ 2,02 đến 12,12 µg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ (R2 = 0,9989).
Vậy phương pháp có thể ứng dụng để định lượng tioconazol trong phương pháp xác định độ tan và xác định hàm lượng TCZ của các mẫu nghiên cứu.
Xây dựng công thức emulgel tioconazol
3.2.1.Xác định độ tan của tioconazol trong các dung môi
Tioconazol là một chất rất ít tan trong nước nên muốn hoà tan DC vào pha nước của emulgel thì cần sử dụng các dung môi đồng tan là ethanol và PG. Tiến hành thử độ tan của DC trong 2 dung môi trên để xác định lượng dung môi thích hợp dùng trong chế phẩm đủ hoà tan DC. Kết quả thử độ tan được thể hiện trong bảng 3.2 như sau:
Bảng 3.2. Độ tan của tioconazol trong các dung môi
Độ tan (g/g)
Độ tan trong dung môi ethanol 0,579 ± 0,0005 Độ tan trong dung môi propylen glycol 0,064 ± 0.0001
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy lượng dung môi ethanol và PG sử dụng trong công thức ở bảng 2.3 đủ để hoà tan hoàn toàn dược chất tioconazol trong pha nước của emulgel.
3.2.2.Khảo sát loại tá dược pha dầu
Đặc điểm của pha dầu có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng của emulgel. Các loại tá dược dầu khác nhau có thể làm thay đổi thể chất, độ đồng nhất và khả năng giải phóng dược chất của emulgel.
y = 0,0653x + 0,0352 R² = 0,9989 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 2 4 6 8 10 12 14 Đ ộ hấp th ụ λ (nm)
28
Emulgel được bào chế bằng phương pháp được mô tả trong mục 2.3 thành phần DC, pha nước, CDH và polyme được giữ nguyên như đã trình bày ở bảng 2.3 còn các thành phần tá dược dầu thay đổi được trình bày trong bảng 3.3. Lựa chọn loại và lượng các tá dược dầu sau khi tham khảo các tài liệu [3], [20], [28], [29].
Bảng 3.3. Các mẫu emulgel với thành phần pha dầu khác nhau
Thành phần Công thức (%kl/kl) F1 F2 F3 F4 Parafin 7 7 7 Miglyol 810 7 IPM 7 7 7 Acid oleic 7 Alcol cetostearylic 3 3 3 Acid stearic 3
Bảng 3.4. Hình thức và độ ổn định của các mẫu emulgel bào chế theo công thức F1, F2, F3, F4 sau bào chế và sau 7 ngày
Đặc điểm Vừa bào chế Sau 7 ngày
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
Sự đồng nhất + + + + + + - +
Màu sắc ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ × ✓
Bọt khí - - - -
Ghi chú: (✓)-màu trắng; (×)-màu vàng; (-)-không; (+)-có Từ kết quả ở bảng 3.4 ta thấy:
– Các mẫu emulgel bào chế theo công thức công thức F1, F2 và F4 ngay khi bào chế và sau 7 ngày bào chế đều đạt yêu cầu về hình thức đã nêu ở mục 2.3.4.1.