- Dung môi tinh khiết HPLC: acetonitril (Fisher, Đức) - Hóa chất dung môi tinh khiết phân tích: acid phosphoric - Huyết tương trắng: viện huyết học và truyền máu trung ương.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260 Infinity
- Cột VertiSepTM GES C18 HPLC (4,6 mm × 250 mm; 5µm) (Thái Lan) - Cân phân tích AND GF-224A.
- Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 220R
- Tủ lạnh âm sâu (-30) Sanyo Biomedical Freezer - Máy siêu âm
- Máy lắc xoáy Votex Mixer K - Máy lọc hút chân không
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu tự tạo là mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn Linezolid.
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị mẫu 2.2.1. Chuẩn bị mẫu
17 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc Linezolid
Dung dịch thuốc tiêm truyền nồng độ 2 mg/mL - Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội gốc
Pha dung dịch gốc của chuẩn nội ở nồng độ chính xác khoảng 1000 mg/L trong methanol.
Dung dịch chuẩn nội làm việc: từ dung dịch chuẩn gốc pha thành dung dịch có nồng độ 100 mg/L trong nước.
- Chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương
Từ dung dịch chuẩn gốc Linezolid, tiến hành pha loãng với nước để thu được dung dịch chuẩn làm việc LNZ trong nước WS-CC có nồng độ LNZ khoảng 1000 µg/ml. Từ dung dịch WS-CC ta chuẩn bị một dãy dung dịch đường chuẩn trong nước có nồng độ khoảng 10 - 500 µg/ml (S1 – S8). Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Đường chuẩn trong nước
Mẫu C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8
Nồng độ (mg/L) 10,0 20,0 50,0 100,0 150,0 200,0 300,0 500,0
VWS-C (mL) 1 1 1 1 1.5 2 3 5
Bđm (mL) 100 50 20 10 10 10 10 10
Các điểm đường chuẩn trong huyết tương được tiến hành như trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương
Mẫu Blank S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 Nồng độ (mg/L) 0 1,0 2,0 5,0 10,0 15,0 20,0 30,0 50,0 Cx - C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 VCx (µL) - 50 50 50 50 50 50 50 50 VHuyết tương người (µL) 500 450 450 450 450 450 450 450 450 - Chuẩn bị mẫu kiểm tra:
Mẫu kiểm tra (WS-QC) được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc và độc lập với đường chuẩn.
18
Chuẩn bị dung dịch WS-QC tương tự như dung dịch WS-CC, sau đó từ WS-QC thu được 3 dung dịch WS-QC1, WS-QC2, WS-QC3 pha trong dung môi nước. Từ 3 dung dịch đó pha vào huyết tương để thành mẫu kiểm tra LQC, MQC, HQC có nồng độ dự kiến như sau:
+ LQC có nồng độ LNZ bằng 1,5 lần nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ)
+ MQC có nồng độ LNZ bằng 50% nồng độ cao nhất của đường chuẩn.(ULOQ) + HQC có nồng độ LNZ bằng 80% nồng độ ULOQ.
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị các dung dịch kiểm tra trong nước
Mẫu WS-QC1 WS-QC2 WS-QC3
Nồng độ (mg/L) 30 250 400
VWS-QC (mL) 1,5 5 4
Bđm (mL) 50 20 10
Bảng 2.5. Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương.
Mẫu LQC MQC HQC
Nồng độ (ppm) 3 25 40
WS-QCx WS-QC1 WS-QC2 WS-QC3
VWS-Q (µL) 50 50 50
VHuyết tương trắng (µL) 450 450 450
2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.2.2.1. Xác định điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội
- Xác định điều kiện sắc kí
Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất lí hóa của LNZ và các công trình nghiên cứu đã công bố [9], tiến hành xây dựng phương pháp định lượng LNZ trên hệ thống sắc kí HPLC Agilent, với pha tĩnh là cột VertiSepTM GES C18. Khảo sát điều kiện sau:
Tỷ lệ pha động, bước sóng ghi sắc kí đồ của detector
Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp để tiến hành định lượng LNZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector PDA.
19 - Lựa chọn chuẩn nội
Thêm 50µl dung dịch chuẩn nội có nồng độ 100ppm vào các mẫu huyết tương trắng đã thêm chuẩn, cho kết quả phân giải tốt và ổn định với LNZ và tách khỏi các tạp nền huyết tương.
2.2.2.2. Xây dựng quy trình xử lí mẫu huyết tương
Dựa trên tính chất lí hóa của LNZ, IS và các công trình nghiên cứu đã được công bố [4][7][10] cùng điều kiện thực tế, quy trình xử lí mẫu dự kiến thiết lập các bước như hình:
Hình2.1. Sơ đồ quy trình xử lí mẫu
Điều kiện sau đây sẽ được khảo sát: Tác nhân tủa protein.
Chuẩn bị các mẫu chuẩn LNZ không qua chiết tách để so sánh đáp ứng pic với các mẫu có nồng độ tương ứng trong huyết tương và tính tỉ lệ thu hồi.
Dựa trên kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lí mẫu phù hợp nhất.
20
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng LNZ trong huyết tương bằng kĩ thuật HPLC với detector DAD theo quy định của US – FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học. [11][12]
2.2.3.1. Độ chọn lọc
Tiến hành xử lí và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa LNZ ở nồng độ 1 µg/mL (mẫu LLOQ)
Ghi lại sắc kí đồ và so sánh tỉ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/mẫu trắng tại thời gian lưu của LNZ và IS.
2.2.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Tiến hành xử lí và phân tích các mẫu chuẩn trong huyết tương có nồng độ LNZ: 1; 2; 5; 10; 15; 20; 30; 50 mg/L được chuẩn bị như đã nếu trong mục 2.2.1. Ghi lại sắc đồ và tỷ lệ đáp ứng pic LNZ/IS tại các nồng độ tương ứng. Xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn sự phụ thuộc của tỉ lệ đáp ứng pic vào nồng độ của LNZ trong mẫu và xác định hệ số tương quan. Từ phương tình hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng tại mỗi nồng độ.
2.2.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Tiến hành phân tích 06 mẫu huyết tương trắng và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương chứa LNZ ở nồng độ 1 µg/mL ( nồng độ thấp nhất của đường chuẩn) và chuẩn nội ở nồng độ thích hợp.
Ghi sắc kí đồ và so sánh tỉ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/ mẫu trắng tại thời gian lưu của LNZ. Tính nồng độ của LNZ trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày. Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực, xác định giá trị CV của các mẫu.
2.2.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành 6 mẫu.
Tính nồng độ của LNZ trong các mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày. Tính độ đúng và chính xác trong ngày của các mẫu chuẩn ở mỗi mức
21
nồng độ. Tính giá trị CV các giá trị độ đúng của 3 ngày các mẫu cùng mức nồng độ từ đó đánh giá độ đúng và chính xác khác ngày của phương pháp.
2.2.3.5. Tỉ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)
Tỉ lệ thu hồi đánh giá khả năng tìm lại của LNZ và IS sau quá trình chiết tách, xử lí mẫu. Xác định độ thu hồi của LNZ và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của LNZ hoặc IS trong các mẫu QC có qua chiết tách, xử lí với đáp ứng tương ứng của các mẫu không qua xử lí, chiết tách (pha mẫu trong nền mẫu). Tiến hành phân tích ở mỗi nồng độ 6 mẫu riêng biệt có qua chiết tách xử lí và không qua chiết tách, xử lí.
2.2.3.6. Đánh giá khả năng nhiễm chéo
Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ ULOQ. Xử lí các mẫu theo quy trình đã xây dựng. Tiêm sắc kí xen kẽ huyết tương trắng sau mỗi mẫu ULOQ.
So sánh đáp ứng pic tại thời gian lưu LNZ và IS của huyết tương trắng và của LLOQ.
2.2.3.7. Độ ổn định
Trong thẩm định phương pháp cần thẩm định
- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc LNZ và dung dịch IS làm việc sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.
- Độ ổn định của mẫu huyết tương sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng - Độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba chu kì đông – rã đông
- Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương - Độ ổn định của mẫu sau xử lí ở nhiệt độ phòng
2.2.4. Phương pháp xử lí kết quả
- Giá trị trung bình, độ đúng, độ chính xác (CV), phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy được xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. - Nồng độ LNZ, trong huyết tương được xác định dựa vào phương trình hồi
quy biểu diễn sự phụ thuộc của tỉ lệ diện tích pic vào nồng độ LNZ được xây dựng trong cùng ngày.
22
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1. Khảo sát, xác định điều kiện sắc lí và lựa chọn chuẩn nội
3.1.1.1. Lựa chọn chuẩn nội
Chất được lựa chọn làm chuẩn nội cần có cấu trúc và tính chất gần giống với chất phân tích. Trong đề tài này, các chuẩn nội không xuất hiện đồng thời với LNZ trên lâm sàng và có thể mua được dễ dàng tại Viêt Nam sẽ được ưu tiên lựa chọn. Dựa trên cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý của chất phân tích và các chất chuẩn sẵn có trong phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát một số chất làm chuẩn nội gồm: acid benzoic, aspirin, acid salicylic, methylparaben(MP).
Điều kiện sắc kí trong quá tình khảo sát như sau:
Pha tĩnh: Cột VertiSepTM GES C18 HPLC (4,6 mm × 250 mm; 5µm) Pha động: acid orthor phosphoric 0,05% : Acetonitril (60:40)
Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
Detector DAD: ghi sắc kí đồ tại 254 nm Thể tích tiêm: 20 µL.
Kết quả sơ bộ cho thấy:
- Với acid benzoic, pic acid benzoic bị chẻ, choãi, không phù hợp để làm nội chuẩn.
23
- Với aspirin, ở cùng nồng độ LNZ và nội chuẩn thì đáp ứng pic của IS nhỏ hơn rất nhiều so với LNZ (nhỏ hơn 10 lần). Bên cạnh đó, thời gian lưu của LNZ và Aspirin khá là gần nhau (4,279 phút và 5,124 phút, Rs = 2,7).
Hình 3.2. Sắc kí đồ với IS là aspirin
- Với nội chuẩn là acid salicylic: đáp ứng pic của acid salicylic nhỏ hơn nhiều so với pic chất chuẩn khi 2 chất ở cùng nồng độ, nâng nồng độ IS lên quá cao thì sẽ không tối ưu hóa.
Hình 3.3. Sắc kí đồ với IS là salicylic
- Với methyl paraben (MP) có thể thấy rằng: pic MP tách tốt so với pic LNZ (Rs = 10,1) và với các tạp trên nền huyết tương; ở cùng nồng độ với chất chuẩn cho đáp ứng khá tương đương, hình dạng pic đẹp, cân đối. Methyl paraben không phải là thuốc, lại được sử dụng phổ biến tại Việt Nam, nên lựa chọn MP làm nội chuẩn cho đề tài này.
24
Hình 3.4. Sắc kí đồ với IS là methylparaben 3.1.1.2. Lựa chọn điều kiện detector
Quét phổ hấp thụ UV của LNZ và IS, ta thu được kết quả như sau:
Hình 3.5. Phổ hấp thụ UV-VIS của Linezolid
25
Phổ hấp thụ của LNZ và IS đều có cực đại hấp thụ ở khoảng 254 nm nên bước sóng này được lựa chọn để ghi sắc kí đồ.
3.1.1.3. Lựa chọn pha động và tỉ lệ pha động
Dựa vào tham khảo một số nghiên cứu đã được công bố [16], kết hợp với quá trình thực nghiệm, pha động được lựa chọn gồm: acid orthor phosphoric 0,05 % và MeCN.
Khảo sát tỉ lệ pha động ở các mức tỉ lệ MeCN là 25, 30, 40, 50. Kết quả khảo sát như sau:
- Tỉ lệ pha động MeCN: dd acid orthor phosphoric 0,05% là 25:75
Hình 3.7. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN:Acid (25:75)
Ở tỉ lệ pha động này, thời gian lưu giữ của LNZ và IS quá dài dẫn đến thời gian phân tích sẽ dài, tốn dung môi hóa chất và không ứng dụng tốt được trên theo dõi điều trị.
- Tỉ lệ pha động MeCN: dd acid orthor phosphoric 0,05% là 30:70
26
Thời gian phân tích khi nâng tỉ lệ MeCN lên 30% vẫn khá dài (hơn 14 phút), không có nhiều cải thiện so với tỉ lệ MeCN là 25%.
- Tỉ lệ pha động MeCN: dd acid orthor phosphoric 0,05% là 40:60
Hình 3.9. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN:Acid (40:60)
Ở tỉ lệ này, thời gian phân tích 10 phút là phù hợp ứng dụng vào phân tích, sự phân giải của LNZ và IS cũng rõ ràng (Rs = 17,5), pic đẹp và cân đối.
- Tỉ lệ pha động MeCN: dd acid orthor phosphoric 0,05% là 50:50
Hình 3.10. Sắc kí đồ mẫu huyết tương ở tỉ lệ MeCN:Acid (50:50)
Ở tỉ lệ này, thời gian phân tích là ngắn hơn so với các tỉ lệ trên, tuy nhiên pic LNZ có xu hướng bị dính vào các pic tạp phía trước của nền huyết tương (Rs = 6,1), không nên tiếp tục nâng tỉ lệ MeCN lên trên 50%.
Như vậy, lựa chọn pha động theo tỉ lệ MeCN : Acid photphoric 0,05% (40:60) là phù hợp hơn.
27
3.1.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lí mẫu Lựa chọn dung môi tủa protein Lựa chọn dung môi tủa protein
Tiến hành tủa protein trong mẫu huyết tương với dung môi methanol và acetonitrile. Có thể nhận thấy rằng: tủa với methanol nền mẫu xuất hiện nhiều pic tạp chất hơn, trong khi tủa bằng acetonitrile thì nền mẫu khá sạch, ít pic tạp. Do đó, lựa chọn acetonitrile để kết tủa protein là phù hợp với đề tài này.
Hình 3.11. Tủa protein trong huyết tương bằng methanol
Hình 3.12. Tủa protein trong huyết tương bằng acetonitril
3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng trong huyết tương bằng HPLC được xây dựng như sau HPLC được xây dựng như sau
Từ các kết quả thực nghiệm đã nêu, phương pháp định lượng LNZ trong huyết tương người bằng HPLC được xây dựng như sau:
28
500 µL mẫu huyết tương được đưa vào ống Eppendorf 2mL, thêm 50µL IS, lắc xoáy bằng vortex trong 5s. Thêm vào 800 uL acetonitrile/methanol để tủa protein. Lắc xoáy vortex trong 10s, sau đó đem li tâm ở 10000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy lớp dịch phía trên tiêm sắc kí.
Điều kiện phân tích sắc kí
- Cột VertiSepTM GES C18 HPLC (4,6 mm × 250 mm; 5µm) - Pha động: MeCN : dd H3PO4 0,05% theo tỉ lệ 40:60
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Detector DAD: ghi sắc kí đồ tại 254nm - Thể tích tiêm: 20 µL
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống phân tích 3.2.1. Độ phù hợp hệ thống phân tích
Chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ LNZ là 25 mg/L trong huyết tương (nồng độ MQC). Xử lí mẫu theo quy trình phân tích đã được xây dựng. Tiêm lặp lại 6 lần mẫu thu được sau xử lí. Ghi lại SKĐ, xác định các thông số đặc trưng của mỗi pic và tỉ lệ diện tích pic giữ các pic hoạt chất và pic chuẩn nội.
Kết quả đánh giá độ ổn định hệ thống được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.1. Đánh giá độ ổn định hệ thống
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Tỉ số diện tích pic LNZ IS LNZ IS 1 4,281 7,119 595,9 444,6 1,34 2 4,283 7,119 587,3 444,0 1,32 3 4,288 7,116 589,3 440,9 1,34 4 4,292 7,102 583,7 441,4 1,32 5 4,295 7,088 582,9 442,6 1,32 6 4,298 7,09 581,8 437,9 1,33 TB 4,290 7,106 586,8 441,9 1,33 CV(%) 0,2 0,2 0,9 0,5 0,7
Kết quả cho thấy: giá trị diện tích của các pic chất phân tích và tỉ lệ diện tích giữa pic LNZ và IS tương ứng đều có độ lặp lại tốt (CV < 2%), thời gian lưu
29
(tR) của tất cả các pic chất phân tích đều có độ lặp lại cao (CV < 1%); ngoài ra, số đĩa lí thuyết trung bình của LNZ là 16853, của IS là 23430; hệ số đối xứng của LNZ trung bình là 0,6, của IS là 0,5; đảm bảo sự phù hợp hệ thống cho phương pháp định lượng LNZ trong huyết tương đang tiến hành.
3.2.2. Độ đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương trắng thêm LNZ nồng độ 10 mg/L, mẫu huyết tương trắng thêm cả chuẩn LNZ (nồng độ LLOQ) và IS nồng