Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ

3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị

 Phễu đổ gel

 Bình hút chân không

 Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 .

 Bình đựng dung dịch đệm  Ống nghiệm: 20 cái

 Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch.

3.7.1.2. Hóa chất

Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng

3.7.1.3. Tinh sạch enzyme

Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có

42

kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích

mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.

Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ:

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Dịch enzyme thô

Ly tâm 10000 vòng/10 phút Dịch trong

Cột Sephadex G100

Cột DEAE

43