1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.5 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu
* Mục đích: xác định sự có mặt của các nhóm chất có trong thân rễ Tam thất gừng để làm cơ sở dữ liệu cho quá trình nghiên cứu và sử dụng dược liệu sau này.
* Tiến hành;
2.5.1. Định tính Glycosid tim.
- Chiết xuất:
Cân khoảng lOg dược liệu tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100 ml cồn 25° ngâm trong 24h hoặc đun sôi cách thuỷ/vài phút. Gạn dịch chiết vào một cốc có mỏ. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều lọc qua giấy lọc gấp nếp. Thử dịch lọc nếu vẫn còn tủa với chì acetat cho thêm Iml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy đều và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với Pb(CH3COO)2. Loại chì acetat thừa bằng dd Na2S04 bão hoà đến khi không còn tủa với Na2S04 nữa. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ 2 lần với Cloroform X 5ml. Gạn lấy dịch Chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ khô, cô cách thuỷ -> cắn. Lấy cắn tiến hành làm các phản ứng định tính.
- Phản ứng Liberman - Bouchardat:
Cho vào 1 ống nghiệm có chứa cắn Iml Anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn. Để nghiêng ống nghiệm 45°. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml H2S04jj để
dịch lỏng chia thành 2 lớp, ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1
vòng màu tím đỏ.
* Kết quả: giữa 2 lớp chất lỏng không thấy xuất hiện 1 vòng màu tím đỏ. - Phản ứng Baijet:
Pha TT Baijet: cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch a.picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml cồn 90°, lắc cho tan hết. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baijet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ cam.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện màu đỏ cam. - Phản ứng Legal:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml EtOH 90° lắc đều cho tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
* Kết luận:
Sơ bộ nhận định trong dược liệu không cố Gỉycosid tim.
2.5.2. Định tính Saponin:
- Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho khoảng 0,5g dược liệu nhỏ vào ống nghiệm 20ml. Thêm lOml H2O cất đun cậch thuỷ 5 - 1 0 phút. Lọc qua bông vào ống nghiệm 20ml thêm H2O cất vđ lOml. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay trái lắc mạnh theo chiều dọc 5
phút, để yên và quan sát cột bọt.
- Quan sát thấy có lớp bọt nhưng không bền, bọt biến mất sau khoảng 1 phút.
* Kết luận:
Sơ bộ nhận định trong dược liệu không cố Saponin.
2.5.3. Định tính Flavonoid:
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thuỷ 10 phút, lọc nóng dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Cyanidin:
Qio Iml dịch chiết vào ống nghiệm thêm 1 ít bột Mg kim loại và 5 giọt HCLj^. Đun cách thuỷ vài phút, dung dịch chuyển sang màu đỏ tươi.
* Kết quả: Dung dịch chuyển nhanh sang màu đỏ tưoi - Phản ứng với Kiềm:
+ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi hơ lên miệng lọ có chứa Amoniac đặc đã mở nút
+ Phản ứng vói NaOH: Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.
* Kết quả: Thấy xuất hiện nhiều tủa vàng. - Phản ứng vói FeClg 5%
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2- 3 giọt dung dịch FeQg 3% trong cồn . * Kết quả: Xuất hiện màu xanh đen rõ rệt.
- Phản ứng với AICI3 3% trong cồn:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd AICI3 trong cồn. * Kết quả: Thấy xuất hiện màu đỏ tươi.
* Sơ bộ kết luận: Dược liệu có Flavonoid
2.5.4. Định tính Coumarin:
- Chiết xuất:
Lấy khoảng lOg dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 50ml cồn 90° đun cách thuỷ 5’, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng.
+ Phản ứng mở đóng vòng Lacton.
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống Iml dịch chiết cồn: Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để nguyên.
Đun cả 2 ống trên nồi cách thuỷ khoảng 2’, để nguội quan sát. Ông 1: Tủa đục màu vàng ( ị trắng)
Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 2ml H2O cất, lắc đều thấy; Ống 1: Trong suốt
Óng 2: Có tủa đục.
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCL(J(J, ống 1 sẽ trở lại đục như ống 2. + Phản ứng Diazo hoá:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2ml NaOH 10% đun cách thuỷ đến sôi, để nguội. Thêm vài giọt TT Diazo mới pha.
* Kết quả: Thấy trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu có Coumarin
2.5.5. Định tính Alcaloid:
Cho khoảng 3g dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc. Đậy kín trong 30 phút. ƠIO 15 ml Clorofoưm lắc đều ngâm 12 giờ. Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn. Sau đó lắc kỹ với 10 ml dung dịch H2SO4. Gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết.
- Ống 1: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện ị trắng. - Ống 2: Nhỏ 1 - 2 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện ị nâu. - Ống 3: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện tủa đỏ cam.
* Sơ bộ kết luận : Dược liệu không có Alcaloid
2.5.6. Định tính Tanin:
Cho vào ống nghiệm Ig dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực tiếp trong 5 phút. Lọc lấy dịch lọc để làm phản ứng.
- Với dung dịch PeCLg 5%: Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt FeCL3 5% lắc đều.
* Kết quả; thấy dung dịch chuyển sang xanh đen ( không rõ )
- Với dung dịch Gelalin 1%: Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dung dịch Gelalin 1% lắc đều.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện tủa bông trắng.
- Với dung dịch chì acetat; Cho 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm thêm 2 -3 giọt dung dịch chì acetat 10%.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện tủa bông trắng. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Tanin
2.5.7. Định tính Anthranoid:
Lấy khoảng 3g dược liệu cho vào bình nón dung tích lOOml. Thêm vào đó 50ml H2SO4 10%, đun sôi cách thuỷ 15 phút, lọc nóng vào bình gạn để nguội rồi lắc với 5ml Ether ethylic, gạn lấy phần Ether ethylic để làm phản ứng.
+ Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm Iml NH4OH 10% lắc đều, lớp Amoniac không xuất hiện màu hồng. Tiếp tục cho từng giọt NaOH
10% vào lắc nhẹ lớp dung môi cũng không xuất hiện màu hồng.
+ Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ lớp nước không có màu đỏ.
- Phản ứng vi thăng hoa: Cho Ig dược liệu vào 1 nắp chai bằng nhôm. Hơ lên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt trên miệng nắp nhôm một lam kính trên có để 1 miếng bông ướt. Đặt nắp nhôm trực tiếp lên nguồn nhiệt, sau 5’ lấy lam kính ra để nguội soi dưới kính hiển vi.
* Kết quả; Không thấy tinh thể xuất hiện
* Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Anthranoid
2.5.8. Định tính Acid hữu cơ:
Cho khoảng Ig dược liệu vào 1 ống nghiệm, thêm 5ml cồn 90° đun sôi nhẹ trong vài phút, để nguội rồi lọc. Thêm vào dịch lọc 1 ít tinh thể Na2C03.
* Kết quả: Không có bọt khí bay ra.
* Sơ bộ kết luận: Dược liệu không cố Acid hữu cơ.
2.5.9. Định tính đường khử:
Lấy khoảng 2g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml H2O đun sôi 2 -3 phút, lọc lấy dịch. Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 10’
* Kết quả: không có tủa đỏ gạch ở dưới đáy ống nghiệm. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Đường khử.
2.5.10. Định tính Acid amin:
Cho khoảng 2g dược liệu vào ống nghiêm to, thêm lOml H2O cất đun sôi 5’, lọc nóng. Lấy 2ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm khác thêm 3 giọt
thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10’. không thấy xuất hiện màu xanh tím.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện màu xanh tím. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu không cố Acid amin
2.5.11. Định tính chất béo:
Lấy khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml. Đổ ngập Ether dầu hoả, đun cách thuỷ 15’, lọc lấy dịch lọc để làm phản ứng. Nhỏ 1
giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi. * Kết quả: Không để lại vết mờ trên giấy lọc
* Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có chất béo.
2.5.12. Định tính Caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2ml dịch chiết Ether dầu hoả, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Thêm vài giọt H2SO4 đặc vào cắn.
* Kết quả: Không thấy xuất hiện màu xanh lục. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu không cố Caroten
2.5.13. Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết Ether dầu hoả, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn. Thêm vào Iml Anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Để ống nghiệm nghiêng 45°. Thêm từ từ Iml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
* Kết quả: Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng không có màu. * Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có Sterol
2.5.14. Định tính Polysaccharid.
Cho 2g bột DL vào 1 cốc có mỏ, Thêm lOml nước cất đun cách thủy sôi 5 phút, lọc nóng. Cho vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol
Quan sát màu 2 ống nghiệm: ống 1 có màu xanh đen đậm so ống 2 có màu đỏ
Kết quả định tính các nhóm chất chính trong thân rễ “Tam thất gừng” được tóm tắt ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong thân rễ “Tam thất gừng ”
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết
quả
Sơ bộ kết luận
Phản ứng Liebermann - Bouchardat -
1 Glycosid tim Phản ứng Legal - Không có
Phản ứng Baijet - Phản ứng Cyanidin +++ r\ Flavonoid Phản ứng với NaOH +++ Có 2 Phản ứng với NH3 +++ Phản ứng vói FeClj 5 % +++ Phản ứng vói AICI33 % ++
3 Saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt - Không có
Phản ứng mở - đóng vòng lacton +++
4 Coumarin Phản ứng với thuốc thử Diazo + Có
5 Anthranoid Phản ứng Bontrager - Không có
Phản ứng vi thăng hoa -
6 Acid hữu cơ Phản ứng với NajCOg - Không có
7 Phản ứng với FeClg 5% +
Tanin Phản ứng với gelatin 5% - Không có
Phản ứng với chì acetat -
Phản ứng với r r Mayer -
9 Alcaloid Phản ứng với '1'1' Dragendoff
- Không có
Phản ứng với '1’1' Bouchardat -
10 Acid amin Phản ứng vói r i' Ninhydrin 3% - Không có
1 1 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có
12 Carolen Phản ứng với H2SO4 đặc - Không có
13 Sterol Phản ứng Liebermann - Không có
14 Polysaccharid Phản ứng vói r r . Lugol + Có
GItii chú:
( + ): Phản ứng dưcíng tính, cường độ màu yếu.
( ++): Phản ứng dương tính, cường độ màu trung bình. (+++): Phản ứng dương tính, cường độ màu mạnh ( - ) : Phản ứng âm tính.
2.6. Nghiên cứu các phân đoạn chiết “Tam thất gùng” bằng SKLM
* Mục đích: - Phát hiện sự có mặt của các thành phần hoá học có trong dược liệu trong các phân đoạn chiết khác nhau dựa vào sắc ký đồ dưói các ánh sáng có bước sóng khác nhau là Ằ, = 254 nm, x = 366 nm, ánh sáng thường khi phun thuốc thử.
- Xây dựng và phân tích sắc ký đồ tạo cơ sở cho quá trình nghiên cứu
và sử dụng dược liệu sau này.
* Tiến hành:
2.6.1. Chuẩn bị dịch chiết chấm sắc ký: Theo sơ đồ 1
- Cân khoảng 10 g dược liệu đã nghiền nhỏ cho vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50ml dung dịch Methanol. Ngâm ở nhiệt độ thường, ơiiết 2-3 lần. Rút dịch chiết rồi cô trên cách thuỷ để được dịch chiết đậm đặc ( Dịch chiết 1)
- Đem sấy khô bã sau khi cất tinh dầu. Chiết 2-3 lần bằng Ethanol 90®. Rút dịch chiết. Một phần dịch chiết đem cô cách thuỷ đến dịch chiết đậm đặc (Dịch chiết 2). Phần còn lại bốc hơi hết dung môi được cắn đặc. Dùng
Qoroform để lắc vód cắn đặc 3 lần mỗi lần 15 ml. Lấy phần dịch chiết
Cloroform. Bốc hơi dung môi đến khi được dịch chiết đậm đặc (Dịch chiết 3)
2.6.2. Tiến hành
- Bản mỏng: Silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn. Đã hoạt hóa ở 110°c/lh. Để bảo quản trong bình hút ẩm.
- Hộ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi; + Hệ dung môi khai triển với dịch chiết:
Hệ I: Toluen : Ethyl acetat; Acid formic ( 5 : 9 ; 1,5 )
Hệ II: Toluen ; Ethyl acetat: Acid formic : H2O ( 6 : 5 : 1,5 : 1)
Hệ ni; Toluen : Ethyl acetat; Acid formic ( 5 : 6 : 1 )
Hệ IV: Ethyl acetat: Acid formic : Nước ( 4 : 1 : 1 )
Hệ V: n- Butanol: Acid acetic : H2O ( 10 : 1: 3 )
Hệ VI: Toluen : Ethyl acetat: Acid formic : H2O ( 2 : 6 : 2 ; 1) Hệ VII; Cloroform : Ethyl acetat ( 4 : 1 )
Hệ VII: Cloroform : MeOH : Acid acetic ( 95 : 4 ; 1 )
Hệ VIII: Ethyl acetat: Acid formic ; Nước ( 8 : 1 : 1 )
Hệ IX; Ethyl acetat: Acid formic : Nước ( 70 : 15 : 15 ) Hệ X: Cloroform : Ethyl acetat: Acid formic ( 5 : 5 : 1 )
- Thuốc thử hiện màu: Vanilin bão hoà trong cồn / H2SO4 đặc
- Chấm sắc ký: Chấm mẫu trên bản mỏng đã được hoạt hoá bằng hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG - Limonat 5.0 sử dụng phần mềm WINCAT và VideoScan để phân tích kết quả.
- Bình sắc ký được bão hoà dung môi, khai triển theo chiều từ dưới lên trên. - Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được sấy nhẹ cho bay hết dung môi. - Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm.
- Sau đó phun thuốc thử hiên màu Vanilin bão hoà trong CỒ11/H2SO4 đặc và quan sát dưới ánh sáng thường.
2.6.3. Kết quả : Trong quá trình thăm dò hệ dung môi chúng tôi nhận thấy hệ II cho kết quả tách tốt nhất, sắc ký đồ, đồ thị biểu diễn sắc ký đồ, bảng biểu thị các giá trị của các dịch chiết với hệ dung môi này được trình bày ở hình sau: Hình 5, 6, 7,8,9,10,11,12,13
Hinti 5; Sac ky thi va bang phan tich ket qua sac ky cua dich c h iltl O’ bu’O’c song 254 nm
P eak Start M ax. End area Subst
# Rf H Rf H m R f H A [%1 N am e 1 0.085 111.3 0.107 232.4 2.39 0.109 231.1 1919.6 0.86 2 0.194 697.8 0.218 870.0 8.93 0.229 807.2 12828.8 5.76 3 0.235 812.1 0.248 960.0 9.86 0.265 45.1 9967.3 4.48 4 0.306 0.0 0.353 1732.5 17.79 0.380 1380.0 43026.9 19.32 5 0.536 1145.3 0.545 1183.8 12.16 0.571 1032.9 17913.7 8.04 6 0.620 1191.4 0.679 2597.9 26.68 0.744 1047.9 106676.0 47.90 7 0.744 1047.9 0.748 1077.6 11.07 0.786 696.5 18111.1 8.13 8 0.786 696.5 0.788 699.6 7.18 0.812 513.9 7402.1 3.32 9 0.353 344.3 0.863 384.0 3.94 0.882 276.5 4873.8 2.19
Total Height 9737.72 Total Area : 222719
(xliBO)
Hinti 6: Sac ky (J6, (Jo Ihj va bang phan tich kit qua sac ky cua dich chiit 1 b bu’oc song 366 nm
Peak Start M ax. End area Subst
# Rf H Rf H l%] Rf H A m Nam e 1 0.000 0.0 0.010 2874.3 6.61 0.027 750.5 18894.8 1.41 2 0.094 912.0 0.174 7927.1 18.24 0.192 5197.0 163512.4 12.19 3 0.192 5197.0 0.270 14844.5 34.16 0.291 14449.6 572823.1 42.70 4 0.291 14449.6 0.293 14453.4 33.26 0.437 1351.3 555801.2 41,43 5 0.467 1100.1 0.469 1115.9 2.57 0.490 870.3 11017.5 0.82 6 0.594 534.3 0.600 612.7 1.41 0.617 363.7 5464.1 0.41